高尿酸增加ROS水平、抑制IRS2-AKT信號通路、誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞INS-1胰島素抵抗.pdf

1、背景：尿酸是食物中嘌呤堿在體內(nèi)代謝及人體細(xì)胞新陳代謝所產(chǎn)生的終產(chǎn)物。當(dāng)體內(nèi)尿酸生成過多或者是體內(nèi)已產(chǎn)生的尿酸排泄減少，都可以導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生。根據(jù)近年來各地高尿酸血癥患病率的報道，目前，我國約有高尿酸血癥者1.2億，約占總?cè)丝诘?0％。高尿酸血癥是痛風(fēng)發(fā)生的病理基礎(chǔ)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥與代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)的其他組分如肥胖、高脂血癥、高血壓、糖代謝紊亂等密切相關(guān)，原發(fā)性高尿酸血癥已成為M

2、S的重要組分之一。高尿酸血癥常與糖代謝異常尤其是胰島素抵抗并發(fā)，但其相互關(guān)系及內(nèi)在機(jī)制尚不明確。已有研究表明，高尿酸血癥可以直接參與糖脂代謝紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、腎損傷、炎癥等重要病理生理過程，并可引起肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激。有研究指出細(xì)胞內(nèi)活性氧的增加可導(dǎo)致細(xì)胞對胰島素的敏感性下降，是胰島素抵抗的危險因素。
　　胰島β細(xì)胞功能紊亂在機(jī)體的胰島素抵抗中處于核心地位。β細(xì)胞在血糖的調(diào)節(jié)

3、過程中具備雙重身份，其既是產(chǎn)生胰島素的主體，又是受胰島素作用的客體。β細(xì)胞上的胰島素受體（IR）、InsR胰島素受體底物1/2（IRS-1/-2）以及各種信號蛋白（PI3K、PKB、PKC、MAPK）等陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，證明β細(xì)胞存在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)高尿酸可以誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的氧化應(yīng)激，抑制胰島素分泌，然而其機(jī)制不甚明了。高尿酸是否誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的胰島素抵抗，及其對胰島β細(xì)胞功能的影響和相關(guān)內(nèi)在機(jī)制等需要進(jìn)一步研究。

4、>　　目的：明確高尿酸誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞胰島素抵抗的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.INS-1細(xì)胞經(jīng)15mg/dl的尿酸溶液處理12小時后，PBS沖洗三遍，加入1:1000用PBS液稀釋DCFH-DA（終濃度為10umol/L）,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30分鐘,用PBS液洗滌細(xì)胞三次，再應(yīng)用倒置熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)，觀察細(xì)胞；或者最后把細(xì)胞消化后十二孔板每孔重懸至500μl PBS,使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

5、r>　　2.INS-1細(xì)胞按5×105密度接種于12孔板，加入15mg/h尿酸培養(yǎng)12h，之后換為添加11.1mmol/L葡萄糖的PBS溶液培養(yǎng)2h，收集培養(yǎng)上清液，通過ELISA方法檢測各組上清液中胰島素濃度。
　　3.INS-1細(xì)胞接種于12孔板，加入15mg/h尿酸培養(yǎng)12h，之后換為添加11.1mmol/L葡萄糖的PBS溶液培養(yǎng)2h，通過電子血糖儀檢測上清液中葡萄糖的含量，計算與初始葡萄糖濃度的差值，即為細(xì)胞攝取葡萄糖消耗

6、量。
　　4.INS-1細(xì)胞經(jīng)尿酸（15mg/dl）處理12h,胰島素100nM/l處理30min，提取蛋白后應(yīng)用western blot方法檢測IRS2(S731)磷酸化水平。為明確HUA是否通過增加氧化應(yīng)激抑制胰島素信號通路，將INS-1細(xì)胞經(jīng)10或20mM的NAC溶液（抗氧化劑）溶液預(yù)處理2h后，再加入15mg/dl的尿酸溶液繼續(xù)共培養(yǎng)12h，繼續(xù)應(yīng)用蛋白免疫印跡（western blot）方法檢測細(xì)胞IRS2(S731)和

7、Akt（S473）磷酸化程度。
　　5.為進(jìn)一步明確高尿酸作用機(jī)制，在INS-1細(xì)胞中加入PI3K/AKT信號通路激動劑IGF-1，激活相關(guān)信號通路，再次檢測INS-1細(xì)胞胰島素分泌量及糖攝取情況變化。
　　結(jié)果：
　　1.高尿酸引起胰島β細(xì)胞INS-1氧化應(yīng)激，抗氧化劑NAC抑制高尿酸誘導(dǎo)的ROS水平升高。
　　2.高尿酸抑制胰島β細(xì)胞INS-1的胰島素分泌，抗氧化劑NAC改善胰島β細(xì)胞的胰島素分泌。
　

8、　3.高尿酸抑制胰島β細(xì)胞INS-1的糖攝取，抗氧化劑NAC改善胰島β細(xì)胞的糖攝取。
　　4.高尿酸增加INS-1細(xì)胞中IRS-2（S731）磷酸化水平，并抑制AKT（S473）磷酸化水平，抗氧化劑NAC恢復(fù)由高尿酸誘導(dǎo)增加的IRS-2（S731）磷酸化和AKT（S473）磷酸化水平下降。
　　5.PI3K/AKT通路激動劑IGF-1可恢復(fù)由高尿酸引起的INS-1細(xì)胞AKT（S473）磷酸化水平下降，并改善INS-1細(xì)胞的胰