增食欲素A通過(guò)增食欲素受體1和AKT信號(hào)通路影響大鼠胰島INS-1細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、前言
　　增食欲素A(orexinA，OXA)和增食欲素B(orexinB)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的下丘腦神經(jīng)肽，通過(guò)激活兩種G蛋白偶聯(lián)受體而發(fā)揮作用，分別為增食欲素受體1(orexinreceptor1，OX1R)和增食欲素受體2(orexinreceptor2，OX2R)。其中OX1R是首先被發(fā)現(xiàn)的，且與orexinA有較高的親和性。大量的資料顯示，orexinA及其受體參與多種生理功能的調(diào)節(jié)，包括攝食、睡眠-覺(jué)醒、生長(zhǎng)、生殖、應(yīng)激、能

2、量代謝平衡及內(nèi)分泌等。最近的研究表明，orexin系統(tǒng)還參與細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控。近來(lái)的研究表明，除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)，外周組織也有orexin系統(tǒng)的表達(dá)。1999年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)大鼠胰腺組織有orexinA、OX1R的表達(dá)，說(shuō)明orexinA及其受體OX1R參與胰島細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)orexinA可在體內(nèi)、體外影響胰島素的分泌，但結(jié)論并不一致，且機(jī)制尚不清楚。另外，關(guān)于orexinA及其受體OX1R對(duì)胰島β細(xì)胞增殖、凋亡的影響

3、研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　體外培養(yǎng)大鼠INS-1細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胰島細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PI3K/AKT)mRNA的表達(dá)情況。Western-blot技術(shù)檢測(cè)胰島細(xì)胞OX1R蛋白磷酸化水平。分別加入不同濃度的orexinA和/或OX1R特異性抑制劑(SB334867)和/或PI3K特異性拮抗劑(wortmannin)和/或AKT特異性拮抗劑(PF-04691502)進(jìn)行干預(yù)，western-blot技術(shù)檢

4、測(cè)細(xì)胞OX1R蛋白表達(dá)及AKT總蛋白及磷酸化蛋白水平;放免法測(cè)定培養(yǎng)液中胰島素分泌濃度;MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖;凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡;Caspase-3分光光度法測(cè)INS-1細(xì)胞caspase-3活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　OXA(10-10M，10-8Mand10-6M)能夠升高OX1RmRNA和磷酸化蛋白的水平，且10-8M和10-6M組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。當(dāng)預(yù)處理OX1R蛋白特異性抑制劑SB334867后，該

5、作用被抑制。增食欲素能夠促進(jìn)INS-1細(xì)胞胰島素的釋放，減少caspase-3的活性。我們用MTT法研究OXA對(duì)INS-1增殖的影響，發(fā)現(xiàn)10-6MOXA能明顯提高細(xì)胞增殖及存活率，且給予AKTantagonist(PF-04691502)和/或PI3Kantagonist(wortmannin)和/或OX1Rantagonist(SB334867)后，該作用被抑制。不同濃度OXA均可減少細(xì)胞凋亡（P＜0.05），同時(shí)通過(guò)經(jīng)特異性抑制劑