還原型β2糖蛋白I抑制ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化和凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　以動脈粥樣硬化(AS)為主要特征的糖尿病大血管并發(fā)癥，是糖尿病致殘、致死的最主要原因。目前動脈硬化發(fā)病機制尚未完全明了。AS的發(fā)生是一個多種因素在多層次上綜合作用的過程。血脂水平的升高伴隨著促炎因子的表達(dá)和免疫反應(yīng)的激活，單核細(xì)胞活化成為巨噬細(xì)胞，血管壁脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致大量ox-LDL生成，巨噬細(xì)胞通過吞噬ox-LDL伴隨一系列信號分子的表達(dá)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝的障礙，并最終形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的形成是AS早期變化的特征性標(biāo)志

2、，巨噬泡沫細(xì)胞的形成及凋亡是動脈粥樣硬化斑塊損傷形成、發(fā)展和崩解的關(guān)鍵。因此探討影響巨噬泡沫細(xì)胞的形成和凋亡的影響因素作為AS治療的新策略日益受到重視。
　　本研究以小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為研究對象，通過ox-LDL誘導(dǎo)構(gòu)建巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞，探討還原型β2糖蛋白Ⅰ(R-β2GPⅠ)和β2GPⅠ對AS過程中泡沫細(xì)胞形成的影響，以及其可能機制。
　　方法:
　　1.構(gòu)建RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型，探討

3、OX-LDL誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的合適濃度。巨噬細(xì)胞在不同濃度的氧化型低密度脂蛋白溶液內(nèi)孵育24h，高壓液相聯(lián)合質(zhì)譜法(HPLC-MS)測定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的含量，MTT法檢測細(xì)胞生長活力。
　　2.RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)并分四組:①對照組:不加干預(yù)因素;②泡沫細(xì)胞組:加入80mg/Lox-LDL;③β2GPⅠ組:加入80mg/Lox-LDL和100mg/Lβ2GPⅠ;④還原型β2GPⅠ組:加入80mg/Lox-LDL和100mg/L

4、還原型β2GPⅠ。共同孵育24h后，用油紅O染色觀察細(xì)胞形態(tài)，HPLC-MS法檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率研究還原型β2GPⅠ和還β2GPⅠ對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.應(yīng)用實時定量PCR法研究還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成中 CD36、SR-B1、ABCA1、ABCG1等脂代謝相關(guān)受體mRNA表達(dá)的影響。
　　4.采用Western

5、Blot技術(shù)檢測還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ對ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成中p38MAPK、JNK/MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其下游促凋亡蛋白關(guān)鍵酶caspase9、caspase3表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.隨著ox-LDL濃度升高，巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量逐漸增加。ox-LDL超過25mg/L時細(xì)胞活力逐漸下降。ox-LDL濃度在80mg/L時構(gòu)建的泡沫細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量適度，油紅0染色可見細(xì)胞內(nèi)存在大量脂

6、滴，HPLC-MS檢測總膽固醇/膽固醇酯超過50％。細(xì)胞活力下降近50％。
　　2.細(xì)胞油紅O染色、細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量檢測顯示:β2GPⅠ組和還原型β2GPⅠ組巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯低于泡沫細(xì)胞組(P＜0.05，P＜0.01)，還原型β2GPⅠ組膽固醇酯/總膽固醇(CE/TC)比值較β2GPⅠ組和泡沫細(xì)胞組均有降低(P＜0.05，P＜0.01)，且還原型β2GPⅠ組膽固醇含量及CE/TC比值較β2GPⅠ組更為減低（P＜0.05，

7、P＜0.01）。說明還原型β2GPⅠ能夠抑制氧化脂質(zhì)誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成，其作用比β2GPⅠ組顯著。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示:泡沫細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率對照組顯著增加（P＜0.01）;β2GPⅠ組和還原型β2GPⅠ組的細(xì)胞凋亡率較泡沫細(xì)胞組均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01;）;總細(xì)胞凋亡率較β2GPⅠ組明顯下降(P＜0.05)。
　　4.Real-time PCR顯示還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ組較泡沫細(xì)胞

8、組巨噬細(xì)胞內(nèi)CD36mRNA明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。還原型β2GPⅠ組CD36mRNA較β2GPⅠ組下降更明顯（P＜0.05）。而且還原型β2GPⅠ較泡沫細(xì)胞組降低ABCA1mRNA表達(dá)(P＜0.05)。β2GPⅠ組ABCA1與泡沫細(xì)胞組無明顯差異。各組的ABCG1 mRNA、SR-B1mRNA水平無明顯差異。
　　5.Western blot檢測結(jié)果，ox-LDL能夠促進(jìn)P38MAPK通路磷酸化并激活其下游促凋亡

9、的蛋白關(guān)鍵酶caspase9、caspase3表達(dá)，而還原型β2GPⅠ與泡沫細(xì)胞組相比可以明顯下調(diào)P38MAPK通路、JNK/MAPK通路的磷酸化水平并抑制caspase9、caspase3的表達(dá)（P＜0.05），從而起到對抗巨噬細(xì)胞凋亡的作用。與泡沫細(xì)胞組相比，β2GPⅠ可以下調(diào)JNK/MAPK通路，而對P38MAPK通路的作用沒有明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.以O(shè)x-LDL誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞成功構(gòu)建巨噬細(xì)胞源

10、性泡沫細(xì)胞。方法簡單簡單，可重復(fù)性好，成模率高。為體外研究動脈硬化的機制及防治提供了良好的平臺。
　　2.還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成，還原型β2GPⅠ作用比β2GPⅠ更為顯著。
　　3.還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ能夠抑制ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞凋亡，還原型β2GPⅠ作用比β2GPⅠ更為顯著。
　　4.還原型β2GPⅠ和β2GPⅠ能夠通過減少CD36mRNA水平來減少膽固醇的攝