齊墩果酸經TBX20-PPARγ-PON2通路抑制ox-LDL誘導HUVEC細胞損傷.pdf

1、目的：復制氧化性低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）氧化損傷模型，從TBX20/PPARγ/PON2信號通路的角度探究齊墩果酸（oleanolic acid，OA）對該模型的保護作用。
　　方法：CCK-8篩選ox-LDL作用24h后損傷HUVECs的合適濃

2、度、OA細胞毒性以及OA預保護時間和濃度。實驗設計分組為：正常對照組、ox-LDL模型組、OA藥物組（10，20，40μmol/L）；酶化學方法檢測各分組細胞中過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮（NO）、總一氧化氮合酶（NOS）的活性或含量；電子自旋共振（ESR)技術檢測細胞內活性氧（ROS）自由基和一氧化氮（NO)自由基的生成量；Real-time PCR和Western bolt技術檢測TBX20、P

3、PARγ、PON2mRNA和蛋白的表達；脂質體瞬時siRNA轉染以及加入抑制劑使細胞中蛋白表達沉默，Western blot檢測TBX20、PPARγ、PON2蛋白表達變化。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析用SPSS軟件。
　　結果：根據(jù)IC50，實驗選取100μg/ml ox-LDL誘導的HUVEC細胞損傷模型；CCK-8結果顯示：與模型組相比，10、20、40μmol/LOA預處理16h后，細胞存活率顯著升高，且有量效依賴關系；酶化學方法檢測

4、表明：與正常組相比，模型組中CAT、 GSH-PX、NOS活性及NO含量明顯降低；而預先給予不同濃度OA預處理16h后，可量效依賴性提高CAT、GSH-PX、NOS活性，增加NO含量（與模型組相比，P<0.05）。ESR結果顯示：模型組中ROS含量明顯增高，而NO含量降低；OA(10、20、40μmol/L)預處理16h后，此時各組細胞中ROS含量與模型組比會顯著降低，而NO含量會升高（P＜0.05）。RT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測結

5、果表明：模型組中TBX20、PPARγ、PON2 mRNA和蛋白表達水平較正常組顯著降低，而各劑量OA組中這三者 mRNA和蛋白表達水平均較模型組顯著升高，且隨OA劑量的增加對TBX20、PPARγ、PON2表達的激活作用逐漸增強，呈劑量依賴關系(P<0.05)；T-bx-siRNA轉染HUVECs細胞后，熒光顯微鏡檢測轉染率可達90％，Western bolt結果顯示與TBX20未沉默組相比，TBX20、PPARγ、PON2表達量明顯

6、降低（P<0.05）;在OA預處理之前提前給予PPARγ抑制劑GW9662（10μmol/L）孵育2h，Western blot結果顯示PPARγ、PON2蛋白水平均明顯降低(P<0.05)，而TBX20蛋白表達量幾乎沒有變化。
　　結論：100μg/mL ox-LDL抑制TBX20/PPARγ/PON2信號通路加速HUVECs氧化損傷；而OA通過激活TBX20/PPARγ/PON2信號通路保護ox-LDL誘導的HUVECs損傷。