鞭毛蛋白分離純化及其在膿毒癥肺損傷中作用的初步探討.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過(guò)酸裂解的方法從甲型副傷寒沙門(mén)氏菌分離出粗制鞭毛蛋白，并經(jīng)除鹽、弱陰離子交換，獲得純化的鞭毛蛋白。用其免疫大鼠，約7-8周后獲得高效價(jià)的抗血清。然后通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔(cecalligationandpuncture,CLP)的方法復(fù)制大鼠膿毒癥急性肺損傷(acutelunginjure，ALI)模型，觀察ALI發(fā)病過(guò)程中①血清和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中鞭毛蛋白含量的變化

2、；②動(dòng)脈血氧分壓(partialpressureofoxygeninartery,PaO2)的變化；③肺濕干比值(wet/dryratio，W/D)的變化；④鞭毛蛋白含量與PaO2和W/D比值的相關(guān)性；⑤血清和BALF中腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)含量的變化。并采用膿毒癥ALI模型，觀察早期應(yīng)用自制的鞭毛蛋白抗血清后①PaO2和W

3、/D比值的變化；②血清和BALF中TNF-α和IL-1β含量的變化。 結(jié)果顯示：(1)純化的鞭毛蛋白經(jīng)SDS檢測(cè)，分子量約為52kD。(2)純化的鞭毛蛋白經(jīng)WesternBlot檢測(cè)，在52kD處見(jiàn)到清楚的蛋白條帶，磷鎢酸負(fù)染掃描電鏡觀察到蛋白呈細(xì)絲狀。(3)雙向免疫擴(kuò)散法檢測(cè)到鞭毛蛋白抗血清效價(jià)為1：64，該血清經(jīng)WesternBlot檢測(cè)，有蛋白條帶位于52kD處。(4)采用盲腸結(jié)扎穿孔的方法，可成功地復(fù)制大鼠膿毒癥肺損傷模

4、型(致傷組)。在致傷過(guò)程中，①血清和BALF中鞭毛蛋白含量逐漸升高，6h后血清中鞭毛蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，12h后BALF中鞭毛蛋白含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)；②PaO2逐漸下降，12h后顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)；③W/D比值逐漸升高，12h后顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)；④血清和BALF中鞭毛蛋白含量變化與PaO2變化呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為-0.939、-0.931，P＜0.01)，血清和BALF

5、中鞭毛蛋白含量與肺W/D比值變化呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r分別為0.935、0.920，P＜0.01)；⑤血清和BALF中TNF-α和IL-1β含量逐漸升高，6h后TNF-α含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，12h后IL-1β含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)；⑥組織病理學(xué)改變：大體觀察，致傷組12h后可見(jiàn)肺臟腫脹，表面有廣泛大小不等的暗紅色斑片狀病灶，切面可見(jiàn)淡紅色或白色泡沫狀液體溢出；光鏡觀察，12h后可見(jiàn)灶性肺間質(zhì)和肺泡水腫，及明顯的

6、肺出血等，表現(xiàn)為以多形核白細(xì)胞(polymorphonuclearleukocyte，PMN)滲出為主的炎癥反應(yīng)，隨時(shí)間進(jìn)行性加重。(5)在復(fù)制膿毒癥肺損傷模型過(guò)程中，早期應(yīng)用鞭毛蛋白抗血清(抗血清組)，發(fā)現(xiàn)抗血清可推遲ALI發(fā)生，表現(xiàn)為①在12h后，PaO2才顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)，W/D比值顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，且在12h和24h時(shí)，PaO2顯著高于對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)致傷組(P＜0.01)，W/D比值顯著低于對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)致傷

7、組(P＜0.01)；②在12h后，血清和BALF中TNF-α含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，且在6h、12h和24h時(shí)，其含量顯著低于對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)致傷組(P＜0.01)；③在24h后，血清和BALF中IL-1β含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，且在12h和24h時(shí)，其含量顯著低于對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)致傷組(P＜0.01)；④到24h后，才觀察到肺組織出現(xiàn)灶性肺間質(zhì)和肺泡水腫，及明顯的肺出血等，表現(xiàn)為以PMN滲出為主的炎癥反應(yīng)。 以上結(jié)