細(xì)胞骨架在皮膚低溫?fù)p傷中的重要作用及低溫保護(hù)劑的相關(guān)研究.pdf

1、背景及目的：低溫保存是低溫生物學(xué)研究中的一項(xiàng)重要技術(shù)，近年來的迅速發(fā)展為臨床醫(yī)學(xué)帶來了許多突破性的進(jìn)展，現(xiàn)在速凍玻璃化已被認(rèn)為是大多數(shù)生物組織低溫下保存的最佳方法，但是如何進(jìn)一步提高儲(chǔ)存皮膚的活力，卻一直沒有得到非常滿意的答案，其關(guān)鍵在于解決低溫的損傷作用。已有學(xué)者認(rèn)為組織低溫保存后產(chǎn)生的效應(yīng)包括細(xì)胞間和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部的改變，而且這些轉(zhuǎn)變均可被細(xì)胞骨架系統(tǒng)所介導(dǎo)。但是，對(duì)于皮膚細(xì)胞骨架蛋白在低溫冷凍損傷中的一些基礎(chǔ)性研究和低溫干預(yù)劑的相關(guān)保

2、護(hù)性研究尚少。眾所周知，皮膚的功能高度依賴于表皮的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，任何損壞或使其功能降低的生物學(xué)行為將導(dǎo)致皮膚活力下降，在低溫醫(yī)學(xué)中充分認(rèn)識(shí)和研究表皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制是非常關(guān)鍵的。本研究的目的旨在研究皮膚低溫儲(chǔ)存后表皮層細(xì)胞骨架蛋白的變化，從而分析其低溫生物學(xué)效應(yīng)，并將幾種低溫保護(hù)劑(Cryoprotectant，CPA)進(jìn)行比較，以期為探索低溫組織保存液的有效成分提供科學(xué)依據(jù)。 方法：在本論文的第一部分實(shí)驗(yàn)中，將皮膚組織采

3、用不同的溫度組(4℃組、-20℃組、-80℃組和-196℃組)進(jìn)行保存，并在保存7天、14天、21天、28天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，設(shè)新鮮皮膚為對(duì)照組。首先通過H.E.染色和免疫組織化學(xué)染色兩種病理學(xué)方法在光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和蛋白的改變，并用圖像分析儀測(cè)定表皮組織中的含量變化。研究的骨架蛋白包括α-微管蛋白(α-tubulin)、β-微管蛋白(β-tubulin)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、高分子量角蛋白(cytoskeratin

4、)。其次，采用透射電鏡觀察微絲、微管和中間絲的變化并進(jìn)行圖象分析。最后我們進(jìn)一步采用RT-PCR和免疫印記法(Western-blot)對(duì)不同方法保存后的β-actin含量進(jìn)行了深入的研究。力求從細(xì)胞骨架系統(tǒng)的重要組成部分中尋找到低溫?fù)p傷的位點(diǎn)，從而尋覓更多關(guān)于抗低溫?fù)p傷的機(jī)理。 第二部分從海藻糖對(duì)皮膚細(xì)胞骨架蛋白的保護(hù)作用入手，探討一種新型的CPA對(duì)低溫儲(chǔ)存皮膚活力的影響。實(shí)驗(yàn)將新鮮成人皮膚分為4組，分別經(jīng)海藻糖/二甲基亞砜(

5、T/D)、二甲基亞砜/丙二醇(D/P)、二甲基亞砜/去血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液(D/K)、DMEM作為低溫保護(hù)劑保存，-196℃液氮凍存7天、14天復(fù)溫，設(shè)新鮮皮膚為對(duì)照組。采用組織病理形態(tài)學(xué)(H.E.染色、免疫組織化學(xué)染色和透射電鏡)、琥珀酸脫氫酶(SDH)測(cè)定及氧耗量測(cè)定方法，對(duì)各組間皮膚活力進(jìn)行比較。并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用RT-PCR和Westernblot方法對(duì)不同低溫保護(hù)劑保存后皮膚的β-actin蛋白含量和基因水平進(jìn)行了深入的研

6、究。 結(jié)果：從第一部分實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果表明：1、皮膚組織低溫儲(chǔ)存后其細(xì)胞骨架蛋白α-tubulin、β-tubulin、β-actin、cytoskeratin超微形態(tài)結(jié)構(gòu)及分布改變，并且蛋白含量下降，它們可能是低溫?fù)p傷皮膚細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的作用位點(diǎn)。2、應(yīng)用不同的溫度儲(chǔ)存皮膚得到不同的保存效果，在-196℃組保存時(shí)細(xì)胞骨架蛋白含量下降較少，形態(tài)改變不顯著。3、隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，低溫對(duì)骨架蛋白的損傷作用愈顯著，-196℃組

7、所保存的皮膚中細(xì)胞骨架蛋白含量亦逐漸下降。 從第二部分實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果表明：1、通過光鏡、電鏡的圖象觀察和蛋白分析結(jié)果說明，海藻糖能夠很好的對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、形態(tài)及其中微絲和中間絲的分布發(fā)揮低溫保護(hù)作用。2、通過皮膚活力的測(cè)定表明，海藻糖/二甲基亞砜組具有提高低溫保存皮膚活力的作用，并優(yōu)于傳統(tǒng)保護(hù)劑組。3、海藻糖在低溫保存過程中，保護(hù)皮膚組織骨架蛋白cytoskeratin和β-actin。其中β-actin的蛋白含量和基