低溫下心肌細胞骨架微管的變化與冷缺血損傷相關性的研究.pdf

1、心臟移植是公認的治療終末期心臟病唯一有效的手段，但由于供體心臟的低溫安全保存期目前僅有4～6小時，極大地限制了心臟移植的開展。因此，如何有效地延長離體心臟安全保存期是心臟移植中亟待解決的問題，而闡明心肌冷缺血損傷的病理生理學機制，尋找更有效的抗心肌冷缺血/再灌注損傷措施則是一個重大的研究課題。細胞骨架是細胞內重要的保守結構，在維持細胞內外的有序性空間結構和細胞的生命活動中起重要作用。由于細胞骨架的完整性與溫度有密切關系，因此，研究低溫環(huán)

2、境下心肌細胞骨架的變化對細胞結構和功能的影響十分必要。該課題依據(jù)近年來國內外在細胞骨架研究方面所取得的新進展，從細胞的結構與功能關系的角度出發(fā)，探討低溫環(huán)境下心肌細胞骨架微管與心肌冷缺血損傷的關系，以及將保護細胞骨架作為新的心肌保護措施的可能性。該研究對于解決器官移植中供體心臟的安全保存難題有重要意義。 本研究分三部分進行： 第一部分進行成年大鼠離體心臟低溫保存和復溫再灌注實驗，在保存液中加入微管穩(wěn)定劑和解聚劑，經(jīng)過6小

3、時低溫保存后，復溫再灌注，檢測冠脈漏出液中心肌酶的含量，同時進行形態(tài)學觀察，探討微管的解聚與穩(wěn)定對離體心臟低溫保存的影響。 第二部分，進行成年大鼠分離心肌細胞低溫保存實驗，分別利用組化免疫熒光和生物化學比色分析的方法，觀察心肌細胞經(jīng)歷低溫保存后微管的變化和心肌酶釋放率以及心肌細胞存活率，探討微管的改變與心肌細胞損傷之間的關系。 第三部分，觀察微管穩(wěn)定劑對低溫保存和復溫再灌注大鼠心肌細胞凋亡發(fā)生的影響；進一步說明細胞骨架與

4、心肌細胞凋亡發(fā)生的關系。 實驗方法： 1、離體鼠心灌流和低溫保存SD大鼠隨機分成3組，包括對照組(HTK液保存)，紫杉酚組(HTK液中含紫杉酚，濃度為10-6M)和秋水仙素組(HTK液中含秋水仙素，濃度為10-6 M)。動物麻醉，氣管插管，呼吸機輔助呼吸，主動脈插入灌注管并迅速取下心臟，在37℃恒溫條件下利用離體鼠心Langendorff灌注模式裝置，進行常規(guī)逆行恒壓有氧灌注，待心肌血流動力學穩(wěn)定后，留取冠脈漏出液，改為

5、經(jīng)主動脈灌注不同的心肌保存液，心臟停跳，放入4℃不同保存液中保存6h，復溫再灌時留取冠脈漏出液，并切取心肌組織做光鏡和電鏡觀察。 2、成年SD大鼠心肌細胞分離灌流方式同前，但是分別用有鈣臺氏液和無鈣臺氏液灌流。再用含Ⅱ型膠原酶和小牛血清白蛋白(BSA)的無鈣臺氏液灌注并消化心臟。然后再用KB液沖洗殘酶。灌流過程持續(xù)充氧飽和。剪碎心室部分，輕輕振蕩，使細胞分離，然后濾過、低速離心、傾出上清液(含部分死亡破碎的細胞)，即得到實驗用細

6、胞，換KB液保存。 3、分離心肌細胞處理方法將每一次分離得到的心肌細胞隨機分為對照組和實驗組，各組設4℃保存0.5h和3h。實驗組添加紫杉酚(最終濃度為10-6M)。分別在相應的保存時間點取出，吸取細胞懸液涂片，進行微管免疫熒光檢測和臺盼藍染色，余下懸液經(jīng)過高速離心后，移出上清液，做LDH活力分析，沉淀細胞用同體積的含1％Triton x-100(Sigma)的PBS 37℃下孵育30min后做LDH活力分析。媒介中(釋放出的)

7、和細胞溶解(保留的)的LDH活力，通過分光光度計和試劑盒檢測出來。LDH釋放以占總LDH活力(釋放+保留)的百分比表示。 4、免疫熒光染色方法分離的單細胞涂片，涼干，然后在冷(-20℃)甲醇中固定3min，再用冷丙酮浸濕三次。放入冰箱，4℃保存，第二日做微管免疫熒光檢測。熒光顯微鏡下觀察拍照，圖像經(jīng)過Image-ProPlus圖象分析軟件(Media cybernetics公司)分析檢測。 5、臺盼藍染色涂片后用0.1％

8、臺盼藍滴染，高倍鏡下(x400)計數(shù)200個細胞，計算拒染的桿形細胞所占的比率。 6、凋亡檢測采用Roche公司檢測試劑盒，運用原位末端脫氧核苷酸轉移酶介導的熒光素脫氧尿嘧啶核苷酸缺口末端標記法(TUNEL)進行凋亡細胞檢測，結果判定：TUNEL陽性細胞核呈現(xiàn)紫色或紫黑色，陰性對照和正常細胞核呈淡粉色。 7、漏出心肌酶檢測采用試劑盒對離體心臟保存前和再灌注后的冠脈漏出液以及分離心肌細胞低溫保存后釋放出的和細胞內殘留的心肌

9、酶進行生物化學比色分析。 8、光鏡和電鏡觀察對心臟低溫保存和復溫再灌注后的心肌進行常規(guī)形態(tài)和凋亡觀察。 實驗結果： 1、分離的成年大鼠心肌細胞低溫下微管的改變低溫保存30min后，細胞微管結構即遭到解聚，表現(xiàn)為免疫熒光減弱，微管結構的連續(xù)性開始喪失，變得粗糙，不光滑，微管結構不清晰。對照組(單純KB液保存)變化明顯突出，保存05.h后微管平均光密度為20.20±1.49，3h后為12.46±1.66；而實驗組(含

10、紫杉酚)變化輕于對照組，保存0.5h后為25.49±1.52，3h后為20.41±1.52，在相同保存時間點實驗組與對照組比較P<0.05。隨著保存時間延長，兩組微管熒光逐漸減弱，微管網(wǎng)絡進行性丟失。 2、分離的成年大鼠心肌細胞低溫下LDH釋放率乳酸脫氫酶(LDH)從保存的心肌細胞中釋放的情況，在經(jīng)過不同保存時間后被檢測。實驗結果表明實驗組(保存液含微管穩(wěn)定劑)低溫保存0.5h后LDH釋放率為51.88％±1.06，3h后為58

11、.87％±1.09，明顯少于對照組(保存液不含微管穩(wěn)定劑)；對照組低溫保存0.5h后LDH釋放率為56.44％±1.45，3h后為65.68％±1.37。在相同保存時間點實驗組與對照組比較P<0.05。 3、分離的成年大鼠心肌細胞低溫下心肌細胞存活率細胞存活率是通過臺盼藍染色的方法觀測到的，實驗結果表明在低溫保存3h后兩組差距明顯，對照組細胞存活率為27.2％±5.05，實驗組為38.80％±2.66。實驗組與對照組比較P<0.

12、05。 4、成年大鼠心臟低溫保存復溫再灌注后心肌光鏡下改變對照組(HTK保存液)心內膜下、心肌層、心外膜下均有水腫，表現(xiàn)為細胞間隙增寬、血管周圍間隙增大，心肌細胞明顯變細、皺縮，但心肌細胞邊緣整齊。紫杉酚組與對照組比較，水腫明顯減輕，心肌細胞周圍間隙變小，心肌細胞邊緣整齊、形態(tài)基本正常；秋水仙素組心壁各層明顯水腫，心肌細胞邊緣不整，細胞周圍間隙較大，部分心肌細胞呈結節(jié)狀溶解。 5、成年大鼠心臟低溫保存復溫再灌注后心肌超微

13、結構改變對照組線粒體腫脹，嵴結構部分溶解，肌質管擴張，但肌節(jié)結構仍然清楚，肌絲結構清晰、無溶解。紫杉酚組無線粒體腫脹，嵴結構正常，肌原纖維排列整齊，肌節(jié)各帶清晰可見，肌質管擴張不明顯。秋水仙素組肌原纖維結構紊亂，肌節(jié)各帶結構不完整，線粒體明顯擴張，線粒體嵴溶解、空化現(xiàn)象嚴重，肌質管明顯擴張，肌膜腫脹，呈指狀突起。 6、成年大鼠心臟低溫保存復溫再灌注后冠脈漏出液中心肌酶的檢測保存后復灌4min時各組心肌酶(LDH，GOT,CK)漏

14、出量以秋水仙素組最多，紫杉酚組最少，對照組次之，三組間差異顯著。 7、成年大鼠心臟低溫保存和復溫再灌注后心肌細胞凋亡的發(fā)生在各對照組和實驗組內，電鏡下觀察都可見到心肌細胞凋亡的核像改變，部分核的染色質向核膜集聚，部分核的染色質積聚成塊，不均勻分布。 原位末端標記(TUNEL法)的切片鏡下觀察可見，發(fā)生凋亡的細胞主要是心肌細胞，少數(shù)為浸潤的淋巴細胞和血管內皮細胞。組內比較和組間比較，結果：(1)在對照組和實驗組內，離體鼠心

15、低溫保存時間與凋亡發(fā)生指數(shù)成正比，低溫保存時間越長凋亡細胞越多(P<0.01)，6h鼠心低溫保存的心肌凋亡細胞數(shù)量明顯多于4h低溫保存的心肌凋亡細胞數(shù)量； (2)在對照組和實驗組內，低溫保存時間越長，對復溫再灌注后的凋亡細胞發(fā)生影響也越大，凋亡細胞數(shù)量越多，即6h低溫保存復溫再灌注后的凋亡細胞數(shù)量明顯多于4h低溫保存復溫再灌注后的心肌凋亡細胞數(shù)量(P<0.01)； (3)在實驗組和對照組內，復溫再灌注后的凋亡細胞指數(shù)明顯高于再灌注前的單

16、純低溫保存的凋亡細胞指數(shù)(P<0.01)，可見復溫再灌注加重了細胞損傷，增加了心肌細胞凋亡數(shù)量；(4)實驗組與對照組相比，在各個保存和再灌注時間點上，凋亡指數(shù)都明顯低于對照組(P<0.01)，含有紫杉酚(10-6 M)的供心保存液THK液具有明顯的低溫供心保護作用。 結論： 1、4℃低溫下，分離心肌細胞保存0.5h心肌細胞微管即發(fā)生解聚，保存3h微管解聚加重，解聚程度與低溫缺血時間成正比。紫杉酚可以穩(wěn)定微管，減輕微管的解

17、聚。 2、4℃低溫下離體心臟心肌細胞損傷、心肌酶(LDH,GOT,CK)釋放，與微管解聚成正相關，穩(wěn)定微管可以減輕心肌細胞釋放LDH、GOT和CK。 3、4℃低溫下可以導致離體心臟線粒體結構受損，微管解聚劑可以加重線粒體損害，微管穩(wěn)定劑可以減輕這種損害。 4、4℃低溫保存可以引起離體心臟心肌細胞凋亡發(fā)生，復溫再灌注能加重凋亡發(fā)生，低溫保存時間越長，復溫再灌注后心肌細胞凋亡發(fā)生的越多。微管穩(wěn)定劑可以減輕低溫保存下心