胞漿中TMEM88與Dvls結(jié)合促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：
　　選擇了多種人類上皮性惡性腫瘤，對(duì)TMEM88的蛋白表達(dá)和定位進(jìn)行了檢測(cè)，尤其是篩選了TMEM88分別表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中的肺癌細(xì)胞系，并通過雙向調(diào)控TMEM88和Dvl的表達(dá)，探討其與Dvl之間的關(guān)系以及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響和可能的作用機(jī)制。
　　材料與方法：
　　一、患者信息和樣本
　　214例非小細(xì)胞肺癌、29例乳腺導(dǎo)管浸潤(rùn)癌、35例結(jié)腸癌、26例肝癌及24例胃癌標(biāo)本均來自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)

2、附屬第一臨床醫(yī)院病理科存檔蠟塊。
　　另收集40例新鮮的肺癌組織及相對(duì)應(yīng)的周圍正常的肺組織標(biāo)本，保存在-70℃冰箱內(nèi)，用于提取蛋白質(zhì)和免疫印記檢測(cè)TMEM88在肺癌組織的表達(dá)情況。
　　二、Western Blot
　　采用RIPA裂解液對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，分別提取其總蛋白，取100微克的總蛋白通過10％濃度的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。5％脫脂奶粉封閉2小時(shí)，一抗CyclinD1，Dv

3、l-1，Dvl-2，Dvl-3; TMEM88-N和GAPDH; Snail, Slug, MMP-7,Myc-tag,HA-tag,Vimentin,P38, p-P38, JNK,p-JNK, ERK,p-ERK, GSK3β, p-GSK3β-Ser9,p-GSK3β-Thr390,p-ATF2,ATF2和p-NF-κb-Ser536;β-catenin, E-cadherin, N-cadherin,NF-κB，和C-myc;

4、Claudin-1; Zo-1和Occludin4℃過夜。山羊抗兔和鼠二抗37℃孵育2小時(shí)。ECL發(fā)光后，Bio-Image system進(jìn)行條帶灰度值測(cè)定，以與GAPDH的比值作為相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取均值。
　　三、免疫組織化學(xué)
　　所有的組織均經(jīng)中性福爾馬林固定，石蠟包埋后，制成4微米厚度的切片。采用S-P免疫組化法進(jìn)行染色。一抗使用多克隆兔源性的TMEM88-N抗體(1∶100)4度孵育過夜。以PBS代替一抗作為

5、空白對(duì)照。生物素標(biāo)記的二抗(Ultrasensitive;MaiXin，F(xiàn)uzhou，China)37℃孵育30分鐘，DAB顯色。
　　每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。根據(jù)計(jì)數(shù)細(xì)胞著色的百分比，TMEM88的表達(dá)被劃分成五個(gè)等級(jí):0分（無著色），1分(1-25％)，2分(26-50％)，3分(51-75％)，4分（76％以上）。再根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)度，TMEM88的表達(dá)又被劃分成3個(gè)等級(jí):0分（無著色），1分（淺

6、黃色顆粒），2分（深黃色或者黃褐色顆粒）。每一張組織切片都對(duì)應(yīng)一個(gè)百分比分?jǐn)?shù)和著色分?jǐn)?shù)，將二者相乘，所得的乘積即為該切片的最終得分。
　　由于目前尚沒有公認(rèn)的TMEM88免疫組化陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)我們?cè)O(shè)定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)68例癌旁正常的肺組織中支氣管和肺泡上皮染色結(jié)果進(jìn)行判讀后發(fā)現(xiàn)，其得分幾乎都小于4分。據(jù)此，我們將大于或者等于4分的定義為陽性表達(dá)，而小于4分者定義為陰性表達(dá)。
　　四、Cell lines
　　HBE細(xì)胞

7、系從ATCC(Manassas，VA，USA)細(xì)胞庫獲得。LK2購買于JCRB細(xì)胞庫(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank),PG-BE1(BE1)和PG-LH7(LH7)是來自北京大學(xué)zhengjie教授的友好惠贈(zèng)，A549、H1299、H460、H157、SPC-A-1(SPC)和LTEP-A-2(LTE)購于上海細(xì)胞庫。細(xì)胞系均用含10％小牛血清(Invitr

8、ogen，Carlsbad，CA，USA)和100U/mL青鏈霉素(Sigma, St.Louis，MO，USA)的1640培養(yǎng)基(Invitrogen)并置于5％濃度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　五、質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　pCMV6-ddk1-myc空載體和pCMV6-ddk1-myc-TMEM88購買于Origene公司（Origene Technologies Inc，Rockville，MD，USA），pCS2+MT

9、-mDvl1質(zhì)粒由羅振革博士（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所）惠贈(zèng)，pMyc-cyto-hDvl3質(zhì)粒由Schultz教授(Department of Chemistry and The Skaggs institute for ChemicalBiology，CA，USA)惠贈(zèng)。GSK3β-HA，Super8x TOP Flash和Super8x FOP Flash購買于Addgene公司， Dvl1/3-siRNA(靶序列A

10、ACAAGATCACCTTCTCCGAG)，Dvl2-siRNA(靶序列 TCCACAATGTCTCTCAATA)，由廣州銳博公司合成，TMEM88-siRNA(sc-93891), NC-siRNA(sc-37007), Snail-siRNA(sc-38398)購于Santa Cruz公司，TMEM88-shRNA和NC-shRNA由上海吉瑪公司合成。采用Lipofectamine2000(invitrogen，Carlsbad，C

11、A USA)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　六、通過上述準(zhǔn)備進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　一、細(xì)胞漿中TMEM88的高表達(dá)與肺癌不良預(yù)后相關(guān)
　　TMEM88在正常支氣管上皮中陰性表達(dá)，在肺癌組織中明顯高表達(dá)，且定位于細(xì)胞漿中，偶見膜表達(dá)和核表達(dá)。TMEM88的高表達(dá)與肺癌的低分化、高TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。TMEM88在

12、乳腺癌等惡性上皮腫瘤中明顯高表達(dá)，同樣定位于細(xì)胞漿.在肺癌細(xì)胞系中，TMEM88僅在LK2中定位于細(xì)胞膜，在其他細(xì)胞中定位于細(xì)胞漿。
　　二、在膜表達(dá)細(xì)胞系中TMEM88抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路而在胞漿表達(dá)細(xì)胞系中的則不能
　　在膜表達(dá)細(xì)胞(LK2)中，轉(zhuǎn)染TMEM88抑制經(jīng)典Wnt活性，及其下游靶基因MMP-7、CyclinD1和C-myc的表達(dá)，但轉(zhuǎn)染TMEM88-△C后則對(duì)Wnt信號(hào)通路活性和其下游靶基因的表達(dá)均無抑制效

13、應(yīng)。在TMEM88漿表達(dá)的細(xì)胞（A549和H1299）中分別轉(zhuǎn)染TMEM88和TMEM88-△C，或在H1299和SPC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染TMEM88-siRNA后，對(duì)經(jīng)典Wnt通路活性和其靶基因的表達(dá)均沒有明顯影響
　　三、無論在膜或漿表達(dá)的細(xì)胞系中， TMEM88均能與Dvl結(jié)合
　　免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):二者在LK2細(xì)胞的胞膜上和H1299細(xì)胞的胞漿中存在著共定位，經(jīng)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)在兩種細(xì)胞中，TMEM88與Dvls存在著相互作用

14、，尤其是與Dvl-1，3亞型的相互作用較強(qiáng)，而與Dvl-2的結(jié)合較弱而轉(zhuǎn)染TMEM88-△C時(shí)二者相互作用明顯減弱且在膜上或漿中的共定位現(xiàn)象消失。提示TMEM88與Dvls的結(jié)合依賴其完整的C端結(jié)構(gòu)。
　　四、 TMEM88的不同定位對(duì)癌細(xì)胞的增殖和侵襲作用不同
　　轉(zhuǎn)染TMEM88后LK2（TMEM88定位于膜）細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移能力明顯被抑制。而在H1299和SPC（TMEM88定位于漿）細(xì)胞中雙向調(diào)節(jié)TMEM88的

15、表達(dá)并不影響其增殖能力，但過表達(dá)TMEM88可以促進(jìn)其遷移和轉(zhuǎn)移能力，而干擾TMEM88的表達(dá)可以抑制其遷移和轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論：
　　1、TMEM88在肺癌細(xì)胞漿中高表達(dá)，與肺癌的惡性表型明顯相關(guān)。
　　2、在膜表達(dá)細(xì)胞中，TMEM88抑制Wnt信號(hào)，在胞漿表達(dá)細(xì)胞中對(duì)Wnt無影響。
　　3、TMEM88與Dvl在LK2中共定位于細(xì)胞膜，在H1299中共定位于細(xì)胞漿。
　　4、在膜表達(dá)細(xì)胞中，TMEM8