孤兒核受體NR4A2調控肝星狀細胞活化的分子機制及其在肝纖維化中的作用.pdf

1、肝纖維化是肝損傷后的自身病理性修復，主要特征是以膠原為主的細胞外基質在肝內過度沉積。肌成纖維細胞是產(chǎn)生膠原的中心細胞，在肝纖維化過程中發(fā)揮關鍵的作用，而活化的肝星狀細胞為其關鍵的細胞來源。
　　眾多細胞因子、信號通路參與肝星狀細胞的活化。但肝星狀細胞活化的確切機制尚未完全明確，尤其是下游的信號通路細節(jié)及信號分子對相關基因的轉錄調節(jié)亟待闡明。近幾年國內外學者開始關注肝纖維化形成中核轉錄因子與肝星狀細胞激活的相關性研究，認為 AP-1

2、、Smads、Foxf1、JunD、cAMP應答元件結合蛋白、c-Myb等眾多轉錄因子能活化肝星狀細胞，促進膠原蛋白分泌。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可通過抑制ERK5信號通路從而抑制肝星狀細胞活化，發(fā)揮抗肝纖維化作用。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)金絲桃苷通過ERK/CREB通路誘導血管平滑肌細胞中NR4A亞家族的表達，抑制其增殖。我們推測NR4A家族可能參與調控肝星狀細胞激活。
　　預實驗結果顯示：(1)肝星狀細胞活化后NR4

3、A2表達明顯減少，NR4A1和NR4A3表達無明顯變化。(2)肝纖維化組織中NR4A2表達明顯減少。
　　因此，我們提出假設：孤兒核受體NR4A2參與調節(jié)肝星狀細胞活化及肝纖維化的形成。
　　目的：探討孤兒核受體NR4A2調控肝星狀細胞活化的分子機制及其在肝纖維化中的作用。
　　方法：(1) PDGF和TGF-β分別刺激HSC-T6細胞，實時定量PCR和Western blot檢測 NR4A2的表達；分離大鼠原代肝星狀

4、細胞，實時定量PCR檢測NR4A2和α-SMA的表達。(2)免疫組化、免疫熒光和定量PCR檢測肝纖維化組織及正常肝組織中NR4A2的表達。(3)構建NR4A2 siRNA小干擾，AdNR4A2腺病毒并轉染肝星狀細胞，定量PCR檢測NR4A2、α–SMA和Col1的表達，流式分析細胞周期和細胞凋亡，CCK8實驗分析細胞增殖能力，Western blot檢測P38，JNK 和ERK1/2蛋白磷酸化水平，細胞熒光實驗檢測核外NR4A

5、2的分布，Transwell分析細胞遷移力。(4) SD大鼠隨機分為4組，注射DMN溶液及AdNR4A2腺病毒，HE、Sirius Red和 Masson染色對肝組織分析，堿水解法檢測肝組織羥脯氨酸含量，TUNEL原位凋亡檢測實驗檢測肝組織內細胞凋亡。
　　結果：(1) HSC-T6細胞(大鼠肝星狀細胞株）活化后NR4A2表達明顯降低，NR4A1和 NR4A3無明顯變化；原代大鼠肝星狀細胞分離后α-SMA上調，而NR4A2明顯下調

6、。(2)人肝硬化組織中NR4A2表達較正常肝組織明顯減少；大鼠肝纖維化組織中NR4A2表達減少，α-SMA表達升高。(3)肝星狀細胞NR4A2敲減，α–SMA和Col1表達上調，細胞凋亡率下降，細胞增殖力增強，處于G1期細胞減少，S期的細胞增多，P38、JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平降低。(4)大鼠原代肝星狀細胞NR4A2高表達，α-SMA mRNA水平下降50%。HSC-T6細胞NR4A2高表達，α-SMA mRNA水平下降70%

7、，細胞凋亡率升高，G1期細胞增多，G2期細胞減少，P38和ERK1/2蛋白磷酸化水平上調，分布于核外的NR4A2明顯增多，細胞遷移力和侵襲力減弱。(5) AdNR4A2腺病毒轉染肝纖維化大鼠后，其肝纖維化程度減輕。模型組大鼠羥脯氨酸含量明顯高于正常組，而AdNR4A2組低于模型組及 AdNC組。肝纖維化大鼠肝組織較正常組NR4A2顯著下調，α-SMA上調，而AdNR4A2組較AdNC組α-SMA下調，NR4A2上調。TUNEL分析顯示正

8、常肝組織中偶見凋亡細胞，AdNR4A2組較 AdNC組凋亡細胞顯著增多。
　　結論：(1)肝星狀細胞活化后NR4A2表達下調，肝纖維化組織中NR4A2表達減少。(2)肝星狀細胞NR4A2敲減促進細胞增殖，減少細胞凋亡，抑制MAPK通路；肝星狀細胞NR4A2過表達阻滯細胞周期，增加細胞凋亡，激活MAPK通路，增加核外NR4A2分布及減弱細胞遷移力和侵襲力。(3) NR4A2體內高表達抑制大鼠肝纖維化，促進肝內細胞凋亡。
　　本