孤兒核受體NR4A2調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化的分子機(jī)制及其在肝纖維化中的作用.pdf

1、肝纖維化是肝損傷后的自身病理性修復(fù)，主要特征是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過(guò)度沉積。肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生膠原的中心細(xì)胞，在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，而活化的肝星狀細(xì)胞為其關(guān)鍵的細(xì)胞來(lái)源。
　　眾多細(xì)胞因子、信號(hào)通路參與肝星狀細(xì)胞的活化。但肝星狀細(xì)胞活化的確切機(jī)制尚未完全明確，尤其是下游的信號(hào)通路細(xì)節(jié)及信號(hào)分子對(duì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)亟待闡明。近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注肝纖維化形成中核轉(zhuǎn)錄因子與肝星狀細(xì)胞激活的相關(guān)性研究，認(rèn)為 AP-1

2、、Smads、Foxf1、JunD、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白、c-Myb等眾多轉(zhuǎn)錄因子能活化肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)膠原蛋白分泌。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可通過(guò)抑制ERK5信號(hào)通路從而抑制肝星狀細(xì)胞活化，發(fā)揮抗肝纖維化作用。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)金絲桃苷通過(guò)ERK/CREB通路誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞中NR4A亞家族的表達(dá)，抑制其增殖。我們推測(cè)NR4A家族可能參與調(diào)控肝星狀細(xì)胞激活。
　　預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)肝星狀細(xì)胞活化后NR4

3、A2表達(dá)明顯減少，NR4A1和NR4A3表達(dá)無(wú)明顯變化。(2)肝纖維化組織中NR4A2表達(dá)明顯減少。
　　因此，我們提出假設(shè)：孤兒核受體NR4A2參與調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞活化及肝纖維化的形成。
　　目的：探討孤兒核受體NR4A2調(diào)控肝星狀細(xì)胞活化的分子機(jī)制及其在肝纖維化中的作用。
　　方法：(1) PDGF和TGF-β分別刺激HSC-T6細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè) NR4A2的表達(dá)；分離大鼠原代肝星狀

4、細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NR4A2和α-SMA的表達(dá)。(2)免疫組化、免疫熒光和定量PCR檢測(cè)肝纖維化組織及正常肝組織中NR4A2的表達(dá)。(3)構(gòu)建NR4A2 siRNA小干擾，AdNR4A2腺病毒并轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞，定量PCR檢測(cè)NR4A2、α–SMA和Col1的表達(dá)，流式分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，CCK8實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖能力，Western blot檢測(cè)P38，JNK 和ERK1/2蛋白磷酸化水平，細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)核外NR4A

5、2的分布，Transwell分析細(xì)胞遷移力。(4) SD大鼠隨機(jī)分為4組，注射DMN溶液及AdNR4A2腺病毒，HE、Sirius Red和 Masson染色對(duì)肝組織分析，堿水解法檢測(cè)肝組織羥脯氨酸含量，TUNEL原位凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝組織內(nèi)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：(1) HSC-T6細(xì)胞(大鼠肝星狀細(xì)胞株）活化后NR4A2表達(dá)明顯降低，NR4A1和 NR4A3無(wú)明顯變化；原代大鼠肝星狀細(xì)胞分離后α-SMA上調(diào)，而NR4A2明顯下調(diào)

6、。(2)人肝硬化組織中NR4A2表達(dá)較正常肝組織明顯減少；大鼠肝纖維化組織中NR4A2表達(dá)減少，α-SMA表達(dá)升高。(3)肝星狀細(xì)胞NR4A2敲減，α–SMA和Col1表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞增殖力增強(qiáng)，處于G1期細(xì)胞減少，S期的細(xì)胞增多，P38、JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平降低。(4)大鼠原代肝星狀細(xì)胞NR4A2高表達(dá)，α-SMA mRNA水平下降50%。HSC-T6細(xì)胞NR4A2高表達(dá)，α-SMA mRNA水平下降70%

7、，細(xì)胞凋亡率升高，G1期細(xì)胞增多，G2期細(xì)胞減少，P38和ERK1/2蛋白磷酸化水平上調(diào)，分布于核外的NR4A2明顯增多，細(xì)胞遷移力和侵襲力減弱。(5) AdNR4A2腺病毒轉(zhuǎn)染肝纖維化大鼠后，其肝纖維化程度減輕。模型組大鼠羥脯氨酸含量明顯高于正常組，而AdNR4A2組低于模型組及 AdNC組。肝纖維化大鼠肝組織較正常組NR4A2顯著下調(diào)，α-SMA上調(diào)，而AdNR4A2組較AdNC組α-SMA下調(diào)，NR4A2上調(diào)。TUNEL分析顯示正

8、常肝組織中偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，AdNR4A2組較 AdNC組凋亡細(xì)胞顯著增多。
　　結(jié)論：(1)肝星狀細(xì)胞活化后NR4A2表達(dá)下調(diào)，肝纖維化組織中NR4A2表達(dá)減少。(2)肝星狀細(xì)胞NR4A2敲減促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡，抑制MAPK通路；肝星狀細(xì)胞NR4A2過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期，增加細(xì)胞凋亡，激活MAPK通路，增加核外NR4A2分布及減弱細(xì)胞遷移力和侵襲力。(3) NR4A2體內(nèi)高表達(dá)抑制大鼠肝纖維化，促進(jìn)肝內(nèi)細(xì)胞凋亡。
　　本