Ala-Gln通過mTOR-p38MAPK信號通路介導(dǎo)仔豬小腸上皮細(xì)胞自噬的研究.pdf

1、本項目旨在應(yīng)用現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)、細(xì)胞系模型、蛋白免疫印跡、實時熒光定量PCR(RT-PCR)等技術(shù)手段，從細(xì)胞和分子水平探究Ala-Gln與仔豬小腸上皮細(xì)胞自噬之間的內(nèi)在關(guān)系及闡明mTOR/p38MAPK信號通路在仔豬小腸上皮細(xì)胞自噬過程中的介導(dǎo)作用。研究結(jié)果將為揭示Ala-Gln調(diào)控仔豬小腸上皮細(xì)胞自噬的作用機制提供理論依據(jù)，并為Ala-Gln在仔豬飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　試驗一 不同濃度Ala-Gln對仔豬小腸上皮細(xì)胞I

2、PEC-1自噬的影響
　　試驗采用單因子設(shè)計，共設(shè)有6個處理，每個處理4個重復(fù)。在體外培養(yǎng)的各組IPEC-1細(xì)胞中分別添加終濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM的Ala-Gln。采用MTT法制定IPEC-1細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線、生長曲線和檢測細(xì)胞活力及待細(xì)胞生長到融合度到達(dá)80％-90％時收集細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot。結(jié)果表明:(1)所有添加Ala-Gln組的細(xì)胞生存率均極顯著大于對照組（P＜0.01），其

3、中3.2mM水平添加組細(xì)胞生存率高于對照組51.08％(P＜0.01);3.2mM水平添加組的細(xì)胞生存率極顯著大于0.2mM、0.4mM水平組(P＜0.01)，顯著大于0.8mM(P＜0.05)(2)隨著Ala-Gln添加量的增加，LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，當(dāng)添加量為1.6mM時LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大值且極顯著高于其他組(P＜0.01)。同時隨著Ala-Gln添加量的增加，p62蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，且各

4、組間差異極顯著(P＜0.01)。由此可知，隨著Ala-Gln添加量的增加，IPEC-1細(xì)胞的自噬逐漸增強。以上結(jié)果提示:Ala-Gln能在一定程度上提高IPEC-1細(xì)胞的生存率，同時Ala-Gln能夠增強IPEC-1細(xì)胞的自噬。
　　試驗二 Ala-Gln調(diào)節(jié)IPEC-1細(xì)胞自噬的mTOR和p38MAPK信號通路研究
　　本試驗以IPEC-1細(xì)胞為體外細(xì)胞模型，采用MTT法檢測不同濃度mTOR和p38MAPK信號通路特異性抑

5、制劑雷帕霉素(Rapamycin RAPA)和SB203580對IPEC-1細(xì)胞活力的影響;然后采用Western blot方法檢測添加特異性抑制劑后對mTOR和p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白的影響，從而研究mTOR和p38MAPK信號通路介導(dǎo)Ala-Gln對仔豬小腸上皮細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果顯示，(1)添加0.11μM RAPA組與對照組之間的細(xì)胞活力無差異(P＞0.05)，隨著RAPA添加量逐漸增加，細(xì)胞活力逐漸下降，且

6、各組間差異極顯著（P＜0.01）;隨著SB203580添加水平的增加，IPEC-1細(xì)胞的活力逐漸降低，且各組之間差異極顯著(P＜0.01)。
　　(2)添加1μMRAPA后，能顯著性降低mTOR（P=0.024）、磷酸化mTOR(p-mTOR)(P=0.016)、p62(P＜0.01)蛋白的表達(dá)量，能夠極顯著的增高LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量(P＜0.01);同時隨著Ala-Gln濃度增加，mTOR、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量極顯著升高（P＜

7、0.01），p-mTOR、p62蛋白的表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01）;Ala-Gln與RAPA對LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)量的交互作用極顯著(P＜0.01)，對p-mTOR蛋白表達(dá)量有顯著的交互作用(P=0.012)。(3)添加40μM SB203580后，對p38MAPK、LC3-Ⅱ蛋白沒有規(guī)律性作用，對磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白具有極顯著的降低作用(P＜0.01)，能極顯著的增加p62蛋白的表達(dá)量(P＜0.01

8、);隨著Ala-Gln添加量的增加，p-p38MAPK、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量極顯著增加(P＜0.01)，p62蛋白的表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01）;Ala-Gln與SB203580對LC3-Ⅱ、p62的蛋白表達(dá)量分別有極顯著交互作用（P＜0.01）和顯著性交互作用（P=0.034）。綜上研究得出，mTOR和p38MAPK信號通路介導(dǎo)Ala-Gln對IPEC-1細(xì)胞自噬的影響，mTOR信號通路能夠抑制IPEC-1細(xì)胞自噬的發(fā)生，p38M

9、APK信號通路可能促進(jìn)IPEC-1細(xì)胞的自噬的發(fā)生。
　　試驗三 Ala-Gln對IPEC-1細(xì)胞mTOR信號通路下游信號分子及其相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　采用單因子試驗設(shè)計，共設(shè)6個處理，每個處理3個重復(fù)。在體外培養(yǎng)的各組IPEC-1細(xì)胞中分別添加終濃度為0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM的Ala-Gln。運用Western blot、熒光定量PCR技術(shù)檢測不同濃度Ala-Gln對mTOR信號通路的影響。結(jié)果表明

10、:(1)在mTOR信號通路中，添加Ala-Gln后，p-mTOR蛋白的表達(dá)量極顯著降低(P＜0.01)。(2)添加Ala-Gln后，ATG13、ULK1的mRNA表達(dá)量均極顯著提高(P＜0.01)，均隨著Ala-Gln濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在Ala-Gln濃度為1.6mM時達(dá)到最大值。p53、Bax的mRNA表達(dá)量均極顯著提高(P＜0.01)，且均隨著Ala-Gln濃度的增加基本呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。綜上所述:添加Ala-G