黃芩苷對(duì)糖氧剝奪誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與壞死的保護(hù)作用.pdf

1、隨著老年化進(jìn)程加快，癡呆的患病率急劇上升，相較于我過(guò)龐大的人口基數(shù)，癡呆逐漸成為我國(guó)一個(gè)重要的公共健康問(wèn)題。癡呆主要分為三種類(lèi)型:阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)以及混合性癡呆。在全世界的癡呆患者中，血管性癡呆大約占20％;并且在亞洲患血管性癡呆人數(shù)已經(jīng)超過(guò)了阿爾茨海默病患者。血管性癡呆患者的5年生存壽命低于阿爾茨海默病，同時(shí)老齡化加快心腦血管疾病成為危

2、害國(guó)民健康的第一大問(wèn)題，對(duì)血管性癡呆的研究重要性也越發(fā)顯現(xiàn)。長(zhǎng)期以來(lái)，廣大科研工作者致力于該疾病的機(jī)制及防治研究，雖取得了較大進(jìn)展，但目前仍缺乏有效干預(yù)和防治該疾病的藥物或措施。
　　黃芩是一味具有悠久歷史的傳統(tǒng)中藥，能清熱解毒，燥濕止血?，F(xiàn)代的藥理學(xué)研究表明黃芩還有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多種藥理作用。黃芩苷(Baicalin)，黃芩根里提取出來(lái)的黃酮類(lèi)化合物，是比較重要的藥理活性成分。在許多的研究顯示，黃芩苷具有抗氧化、抗

3、炎等作用，能夠改善有心肌缺血損害。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)以缺糖缺氧誘導(dǎo)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd.3 cell)損害，建立糖氧剝奪模型(oxygen-glucose deprivation，OGD)，模擬腦缺血缺氧損害病理。研究黃芩苷對(duì)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞糖氧剝奪誘導(dǎo)凋亡和壞死的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.構(gòu)建糖氧剝奪模型(OGD)，將貼壁好的內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)置換無(wú)糖培養(yǎng)基，放入定制的無(wú)氧裝置，運(yùn)用MTT

4、法檢測(cè)證明模型建立成功與穩(wěn)定。
　　2.通過(guò)MTT法、LDH法證明黃芩苷對(duì)糖氧剝奪誘導(dǎo)細(xì)胞損害有保護(hù)作用;
　　3.通過(guò)流式檢測(cè)方法檢測(cè)黃芩苷(100μM)對(duì)糖氧剝奪誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞晚期凋亡、壞死的影響
　　4.透射電鏡、Hoechst33258/PI雙染法分別觀察黃芩苷對(duì)糖氧剝奪誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損害形態(tài)改變影響;
　　5.通過(guò)ROS測(cè)定驗(yàn)證黃芩苷具有抗氧化作用進(jìn)一步說(shuō)明黃芩苷對(duì)糖氧剝奪誘導(dǎo)細(xì)胞損害的保護(hù)

5、作用。
　　結(jié)果:
　　1.OGD模型構(gòu)建
　　OGD誘導(dǎo)小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在2、4、6h損害明顯，在2、4、6h三個(gè)時(shí)間的細(xì)胞存活率的百分?jǐn)?shù)分別為((x)±s):62.31±2.91、48.32±0.49、36.95±6.46，模型組細(xì)胞存活率低于對(duì)照組比較(p＜0.05)。
　　2.黃芩苷對(duì)OGD誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　黃芩苷對(duì)OGD誘導(dǎo)2、4、6 h bEnd.3細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

6、在2、4、6h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，模型組細(xì)胞存活率低于正常對(duì)照組(p＜0.05)，黃芩苷100μ M和200μM組，與模型組比較，藥物對(duì)細(xì)胞有明顯保護(hù)作用(p＜0.05)。
　　黃芩苷對(duì)OGD誘導(dǎo)2、4、6 h bEnd.3細(xì)胞上清液LDH含量影響，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞上清液LDH含量增加(p＜0.05)、與模型組比較，黃芩苷100μ M和200μ M組細(xì)胞上清LDH漏出量降低(p＜0.05)。特別在誘導(dǎo)6h后，與模型組比較，用藥組

7、細(xì)胞上清液LDH含量減少明顯(p＜0.05)。
　　3.黃芩苷抗凋亡作用:Annexin-Ⅴ-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組Annexin-Ⅴ（+/-）/PI(+)ratio增加明顯，細(xì)胞晚期凋亡和壞死多，(p＜0.05);與模型組組比較，黃芩苷組Annexin-Ⅴ（+/-）/PI(+)明顯減少，對(duì)細(xì)胞晚期凋亡和壞死有減少，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.Hoechst33258/

8、PI熒光雙染檢測(cè)
　　黃芩苷對(duì)糖氧剝奪6 h bEnd.3細(xì)胞Hoechst33258/PI熒光雙染檢測(cè)結(jié)果:與正常組比較，模型組同時(shí)染上兩種染料的細(xì)胞明顯多，表示壞死和晚期凋亡細(xì)胞增加;與模型組比較，黃芩苷100μM組細(xì)胞雙染少，壞死和晚期凋亡細(xì)胞少。
　　糖氧剝奪誘導(dǎo)2、4、6h以及黃芩苷對(duì)bEnd.3細(xì)胞形態(tài)改變實(shí)驗(yàn)結(jié)果:糖氧剝奪損害2、4、6h，2、4h細(xì)胞空泡逐漸增多，存在凋亡;6h細(xì)胞質(zhì)融解，核碎裂細(xì)胞壞死。加入

9、黃芩苷100μM細(xì)胞形態(tài):細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞器完整，與OGD損害6h比較，細(xì)胞形態(tài)比較完整，黃芩苷保護(hù)作用較明顯。
　　5.黃芩苷對(duì)OGD誘導(dǎo)6 h bEnd.3細(xì)胞內(nèi)ROS含量結(jié)果:OGD6h模型組組與正常組比較，ROS含量增加明顯;黃芩苷100μM組與模型組比較細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯減少。
　　結(jié)論:
　　1.OGD誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損害明顯，且細(xì)胞損害程度隨時(shí)間增加而損害增加的趨勢(shì)，OGD誘導(dǎo)損害模型穩(wěn)定，能達(dá)

10、到預(yù)期實(shí)驗(yàn)損害要求
　　2.黃芩苷能明顯減少糖氧剝奪誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞損害的作用，保護(hù)作用沒(méi)有明顯的藥物劑量依賴(lài)的現(xiàn)象。同時(shí)能減少細(xì)胞上清液中LDH的含量，并且黃芩苷對(duì)減少細(xì)胞上清液中LDH的含量在糖氧剝奪誘導(dǎo)6h作用最明顯。
　　3.黃芩苷能明顯減少糖氧剝奪誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞晚期凋亡和壞死。
　　4.黃芩苷能減少糖氧剝奪誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞壞死，維持細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
　　5.黃芩苷能明顯減少糖氧剝奪誘導(dǎo)

11、細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，具有明顯的抗氧化作用。
　　黃芩苷減少糖氧剝奪誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，減少對(duì)bEnd.3細(xì)胞的損害。同時(shí)，黃芩苷能維持細(xì)胞的生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，防止細(xì)胞質(zhì)溶解，細(xì)胞核碎裂，細(xì)胞器腫脹等，減少細(xì)胞晚期凋亡和壞死。通過(guò)分析本次實(shí)驗(yàn)，可發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對(duì)糖氧剝奪誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞的損害的保護(hù)作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞晚期凋亡和壞死的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其中ROS的變化參與其中。但是，細(xì)胞的存活需要能量供應(yīng)，在糖氧剝奪的條件下，細(xì)胞能量