Toll樣受體2與肝癌發(fā)生機(jī)制研究.pdf

1、肝癌是一種死亡率較高、嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。慢性病毒感染、代謝異常以及毒性攝入等都是肝癌發(fā)生的重要原因。肝癌的發(fā)生除了與肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞本身的基因突變有關(guān)之外，與所處的免疫微環(huán)境關(guān)系密切，包括腫瘤局部的細(xì)胞因子、趨化因子等蛋白的表達(dá)變化，抑制性免疫細(xì)胞（包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，M2型巨噬細(xì)胞或是髓系來源的抑制性細(xì)胞）的浸潤和抗腫瘤細(xì)胞(NK細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞)的耗竭等諸多方面。抑制性細(xì)胞因子IL-10，TGF-β等上調(diào)表達(dá)以及免疫抑制細(xì)

2、胞的聚集是腫瘤發(fā)生時(shí)普遍存在的現(xiàn)象，也成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵干預(yù)靶點(diǎn)。
　　Toll樣家族分子在腫瘤進(jìn)程中的作用已經(jīng)多有報(bào)道，不同的TLR分子可能發(fā)揮不同的作用，探明不同的TLR分子在腫瘤發(fā)生中的作用對腫瘤治療具有重要意義。TLR7，TLR8，TLR9激動(dòng)劑可以用于治療小鼠腫瘤，已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。本研究中我們首次證明TLR2激動(dòng)劑可以用于肝癌的治療。我們首先采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了化學(xué)藥物誘發(fā)的肝癌中肝細(xì)胞上TLR2分子的表達(dá);之

3、后采用TLR2缺陷小鼠，通過組織染色、免疫組化以及熒光定量PCR等方法檢測了TLR2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)動(dòng)力學(xué);接著我們通過腫瘤判定，流式分析細(xì)胞亞群變化，免疫印跡等方法發(fā)現(xiàn)caspase-8-IL-18-MDSC軸的過度活化是TLR2缺陷鼠易感腫瘤的原因;同時(shí)采用IL-18過表達(dá)質(zhì)粒注射、IL-18沉默、caspase-8干擾等技術(shù)，證明TLR2對caspase-8-IL-18軸的負(fù)調(diào)效應(yīng);最后激動(dòng)劑活化TLR2，實(shí)現(xiàn)了對肝癌小鼠的

4、免疫治療。
　　基于以上研究思路以及實(shí)驗(yàn)方法，我們?nèi)〉昧艘韵聦?shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.肝癌發(fā)生過程中TLR2分子表達(dá)下調(diào)和TLR2活化能夠抑制腫瘤生長本研究建立小鼠自發(fā)肝癌模型來研究TLR2分子在肝癌發(fā)生中的作用。在化學(xué)藥物二乙基亞硝胺誘導(dǎo)8個(gè)月后所有小鼠均發(fā)生肝癌。通過流式細(xì)胞術(shù)以及蛋白質(zhì)免疫印跡等方法，我們發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞上TLR2分子表達(dá)下調(diào)。同時(shí)我們采用TLR2激動(dòng)劑Pam3CSK4進(jìn)行DEN腫瘤模型小鼠TLR2信號的長期活化，

5、發(fā)現(xiàn)TLR2分子活化后能夠減緩肝癌的發(fā)生。這些研究結(jié)果說明TLR2分子可能在肝癌發(fā)生中發(fā)揮作用。
　　2.TLR2缺陷鼠易感自發(fā)性肝癌此后，我們引入TLR2缺陷小鼠進(jìn)行DEN腫瘤模型的誘導(dǎo)。TLR2缺陷小鼠在誘導(dǎo)8個(gè)月以后能夠發(fā)生更加嚴(yán)重的腫瘤。組織病理學(xué)分析能夠看到更大的腫瘤區(qū)域，并且肝細(xì)胞表現(xiàn)更強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力(PCNA+)。同時(shí)通過熒光定量PCR的方法能夠檢測到更多腫瘤指標(biāo)甲胎蛋白(AFP)的表達(dá)，說明TLR2分子在小鼠自發(fā)

6、肝癌中起保護(hù)作用。
　　3.TLR2缺陷鼠中免疫細(xì)胞處于耗竭狀態(tài)我們同時(shí)檢測了腫瘤小鼠中免疫細(xì)胞的狀態(tài)。盡管T細(xì)胞在DEN誘導(dǎo)的肝癌模型中的作用在免疫缺陷鼠(Rag1-/-)中已得到確認(rèn)，但是在TLR2缺陷鼠中所處狀態(tài)還不清楚。我們發(fā)現(xiàn)，DEN處理后TLR2缺陷鼠肝臟以及脾臟CD8+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1，同時(shí)產(chǎn)生TNF-α以及穿孔素的能力降低。這些結(jié)果說明TLR2缺陷鼠在DEN誘導(dǎo)后免疫細(xì)胞處于耗竭狀態(tài)。
　　4.TLR2缺

7、陷小鼠經(jīng)DEN誘導(dǎo)以后表達(dá)更多的髓系來源抑制樣細(xì)胞小鼠經(jīng)DEN誘導(dǎo)之后，單核樣MDSC（CD45+CD11 b+Ly6G-Ly6Chigh）在TLR2缺陷小鼠各臟器中均表達(dá)升高。對單核樣MDSC進(jìn)行時(shí)間動(dòng)力學(xué)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在DEN誘導(dǎo)5月以后TLR2缺陷小鼠肝臟中MDSC明顯多于野生鼠。同時(shí)，TLR2缺陷鼠的肝臟中表達(dá)較高水平的iNOS，并且阻斷其表達(dá)后能夠恢復(fù)T細(xì)胞功能。此外，我們對來源于野生鼠以及TLR2缺陷小鼠的MDSC的功能進(jìn)行了比

8、較，發(fā)現(xiàn)兩者抑制T細(xì)胞增殖以及產(chǎn)生IFN-γ的能力沒有區(qū)別，并且兩者活化表型相似。只有TLR2缺陷鼠的MDSC表達(dá)較高水平的ki-67，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明來源于TLR2缺陷鼠的單核樣MDSC是通過增加MDSC的數(shù)量，進(jìn)而產(chǎn)生大量的iNOS來發(fā)揮抑制T細(xì)胞功能的。
　　5.來源于肝細(xì)胞的IL-18能夠誘導(dǎo)髓系來源的抑制樣細(xì)胞產(chǎn)生接下來，我們就對MDSC增多的機(jī)制進(jìn)行了探索。首先，通過熒光定量PCR的方法，我們對多種細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測。

9、結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有IL-18的mRNA在TLR2缺陷鼠中是上調(diào)表達(dá)的。并且通過免疫組化以及蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)可以看到IL-18主要是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的。在TLR2缺陷鼠中觀察到IL-18與MDSC表達(dá)的正相關(guān)性，提示我們IL-18可能具有誘導(dǎo)MDSC的作用。為了驗(yàn)證這一猜測，我們首先檢測了MDSC上IL-18受體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DEN處理后單核樣MDSC上確實(shí)表達(dá)較高水平的IL-18受體。同時(shí)我們通過體外培養(yǎng)以及體內(nèi)IL-18過表達(dá)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了I

10、L-18能夠誘導(dǎo)MDSC產(chǎn)生。
　　6.肝細(xì)胞特異性干擾IL-18能夠降低髓系來源的抑制樣細(xì)胞的聚集并減緩腫瘤的發(fā)生我們進(jìn)行了體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-18對MDSC以及腫瘤發(fā)生的影響。當(dāng)在腫瘤發(fā)生過程中使用高壓注射的方式干擾掉肝細(xì)胞中IL-18的表達(dá)以后，盡管在野生鼠中沒有看到腫瘤發(fā)生程度的區(qū)別，干擾IL-18的表達(dá)能夠明顯減輕TLR2缺陷小鼠的腫瘤發(fā)生程度，同時(shí)單核樣MDSC的細(xì)胞比例明顯下調(diào)，CD8+T細(xì)胞功能得到恢復(fù)。

11、　　7.TLR2缺陷鼠中IL-18的產(chǎn)生依賴于caspase-8我們對TLR2分子調(diào)控IL-18的機(jī)制進(jìn)行了探究。在DEN處理后，TLR2缺陷小鼠肝臟中表達(dá)更高水平的caspase-8，而當(dāng)使用Pam3CSK4進(jìn)行活化后caspase-8的表達(dá)降低，這就提示我們caspase-8可能與IL-18的產(chǎn)生有關(guān)。因此，我們構(gòu)建了caspase-8的干擾質(zhì)粒對肝細(xì)胞進(jìn)行特異性干擾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TLR2缺陷鼠中干擾caspase-8以后，血清ALT

12、以及IL-18的表達(dá)水平明顯降低，說明TLR2分子調(diào)控IL-18的表達(dá)是通過caspase-8來完成的。
　　8.TLR2激動(dòng)劑Pam3CSK4處理能夠降低髓系來源的抑制樣細(xì)胞聚集并且恢復(fù)抗腫瘤免疫應(yīng)答根據(jù)之前的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)TLR2激動(dòng)劑能夠減緩腫瘤的發(fā)生。在本部分研究中，我們發(fā)現(xiàn)Pam3CSK4處理后能夠同時(shí)降低單核樣以及粒細(xì)胞樣MDSC的比例以及細(xì)胞絕對數(shù)。血清中IL-18的表達(dá)水平在TLR2活化后明顯降低。此外，我們發(fā)

13、現(xiàn)TLR2激動(dòng)劑處理后能夠明顯上調(diào)活化的CD8+T細(xì)胞的比例以及絕對數(shù)。同時(shí)，在抗腫瘤免疫中起重要作用的細(xì)胞因子的表達(dá)得到明顯恢復(fù)。這些結(jié)果說明TLR2激動(dòng)劑能夠通過抑制IL-18-MDSC-CTL軸來減緩腫瘤的發(fā)生。
　　結(jié)論:我們的研究揭示了在肝癌發(fā)病過程中TLR2分子扮演的重要角色。TLR2分子缺失能夠加劇IL-18介導(dǎo)的免疫抑制，而TLR2活化則能夠逆轉(zhuǎn)這一機(jī)制并最終減緩腫瘤的發(fā)生。這一研究成果為肝癌的免疫治療提供了新的思