Exosome介導的miRNA分子在乳腺癌對阿霉素耐藥性中的作用研究.pdf

1、乳腺癌細胞的耐藥性是近年來乳腺癌患者化療失敗、復發(fā)率高的一個主要原因。其耐藥機制有凋亡抑制、耐藥相關(guān)蛋白的高表達、微小RNA的異常表達等。外泌體（exosome）是一種由細胞分泌的納米級小囊泡，富含多種RNAs、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)，它可以作為信息載體，在細胞間進行物質(zhì)和信息的傳遞。腫瘤細胞分泌的外泌體與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、免疫耐受以及耐藥性密切相關(guān)。另外，有研究報道了多種microRNA與腫瘤的耐藥性相關(guān)。例如：miR-302，miR-369，

2、miR-200c，miR-34a，miR-222等。因此，本研究以乳腺癌細胞來源的外泌體為研究對象，探討乳腺癌細胞外泌體及其相關(guān)miRNA與腫瘤耐藥性的關(guān)系，及其可能的作用機制，為腫瘤多藥耐藥的基因治療提供新的思路。
　　一、外泌體在乳腺癌細胞間傳遞阿霉素耐藥性
　　目的：提取乳腺癌細胞外泌體并進行鑒定，觀察MCF-7/ADR細胞的外泌體能否在細胞間傳遞阿霉素耐藥性。
　　方法：
　　1外泌體的提取與鑒定：采用試

3、劑盒和超高速離心的方法提取人乳腺癌細胞MCF-7和人乳腺癌耐阿霉素（adriamycin，ADR）細胞MCF-7/ADR的外泌體，用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)與大小，并運用Western Blot技術(shù)檢測外泌體的跨膜蛋白CD9的表達水平。
　　2外泌體對乳腺癌細胞MCF-7耐藥性的影響：提取MCF-7/ADR細胞外泌體(ADR/exo)，BCA法對外泌體進行定量；將ADR/exo用DiO進行染色標記，用激光共聚焦顯微鏡觀察ADR/e

4、xo是否可以通過胞吞作用進入MCF-7細胞；用MTT法檢測ADR/exo與MCF-7細胞共培養(yǎng)后， MCF-7細胞的增殖率，以及對阿霉素的耐藥性的變化。
　　結(jié)果：
　　1.通過試劑盒和超高速離心法都可以得到人乳腺癌細胞MCF-7和人乳腺癌耐阿霉素細胞MCF-7/ADR的外泌體。透射電子顯微鏡下，外泌體大小為30-100 nm，呈現(xiàn)雙層膜的結(jié)構(gòu)。Western Blot結(jié)果顯示，外泌體跨膜蛋白CD9高水平表達。
　　2

5、.激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示， MCF-7/ADR細胞的外泌體（ADR/exo）與敏感株細胞MCF-7共培養(yǎng)時，ADR/exo可以進入MCF-7細胞內(nèi)部。MTT結(jié)果顯示，與ADR/exo共培養(yǎng)的MCF-7細胞的增殖能力顯著降低，差異具有顯著性（P<0.05）。隨著外泌體含量由多到少， MCF-7細胞的增殖能力依次下調(diào)16％、24%、43%、24%。MTT結(jié)果顯示，MCF-7細胞與ADR/exo共培養(yǎng)后，對阿霉素的耐藥性明顯提高，差異具有顯

6、著性(P<0.05）。由高濃度到低濃度，對阿霉素的耐藥性依次增加5%、25%、40%、30%、29%、24%。
　　結(jié)論：
　　1.人乳腺癌細胞MCF-7和其耐藥株MCF-7/ADR都可以分泌外泌體，通過試劑盒和超高速離心法都可以提取得到，得到的外泌體高表達CD9跨膜蛋白。
　　2.MCF-7/ADR細胞的外泌體能夠進入MCF-7細胞內(nèi)部，使細胞的增殖能力降低，并通過某些機制在細胞間傳遞阿霉素耐藥性，使受體細胞對阿霉素

7、的耐藥性明顯提高。
　　二、乳腺癌細胞外泌體及其相關(guān)miRNA與腫瘤耐藥性的關(guān)系
　　目的：分析乳腺癌細胞及其外泌體中耐藥相關(guān)microRNA的表達差異，選取目標microRNA分子，用軟件預測其可能的靶分子，通過microRNA分子類似物和抑制劑研究目標分子及其靶分子的表達變化，探討乳腺癌細胞外泌體及其相關(guān)miRNA與阿霉素耐藥性的關(guān)系，及其可能的作用機制。
　　方法：
　　1.耐藥相關(guān)的microRNA分子的

8、篩選：利用給total RNA加尾的方法，運用qRT-PCR技術(shù)在microRNA的水平對MCF-7細胞、MCF-7/ADR細胞、MCF-7細胞外泌體（MCF-7/exo）、MCF-7/ADR細胞外泌體（ADR/exo）的多個耐藥相關(guān)的microRNA的表達進行定量分析，篩選出表達差異大的目標microRNA分子進行后續(xù)實驗。
　　2.目標microRNA分子在乳腺癌細胞內(nèi)可能的靶分子的篩選：利用生物信息學軟件，預測與乳腺癌耐藥性

9、相關(guān)的，與目標microRNA分子的3'UTR區(qū)有部分結(jié)合的靶基因。運用qRT-PCR技術(shù)在mRNA的水平對MCF-7細胞、MCF-7/ADR細胞、MCF-7/exo、ADR/exo中的多個靶基因的表達進行定量分析，篩選出可能的靶基因進行后續(xù)實驗。
　　3.目標 microRNA分子與細胞內(nèi)靶分子的作用關(guān)系：合成目標microRNA分子類似物及其抑制劑，并將其轉(zhuǎn)染入 MCF-7細胞、MCF-7/ADR細胞。qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細

10、胞及其外泌體中目標microRNA分子及其靶蛋白的mRNA表達變化。Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)靶蛋白的表達變化。
　　4.目標 microRNA分子對乳腺癌細胞耐藥性的影響：將目標microRNA分子類似物或抑制劑轉(zhuǎn)染入MCF-7/ADR細胞，MTT法檢測細胞對阿霉素的敏感性的變化。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示，與MCF-7細胞和MCF-7/exo相比，MCF-7/ADR細胞和ADR/ex

11、o中的miR-222-5p，miR-17-5p，miR-34a-5p，miR-let-7a，表達均具有顯著性差異（P<0.05），細胞內(nèi)miR-21-5p，miR-125b-5p和外泌體內(nèi)miR-342-3p沒有顯著性差異。其中，miR-34a-5p在MCF-7/ADR細胞中表達顯著降低，而在ADR/exo中表達顯著升高。
　　2.通過軟件預測，得到4個與乳腺癌耐藥性相關(guān)的，可與miR-34a-5p結(jié)合的靶基因：NOTCH1、HD

12、AC1、mTOR、HDAC7。qRT-PCR結(jié)果顯示，與MCF-7細胞和MCF-7/exo相比，MCF-7/ADR細胞和ADR/exo中靶基因在mRNA水平上均有顯著性差異（P<0.05）。NOTCH1、HDAC1、mTOR、HDAC7，在細胞中的表達為1.85±0.012，1.23±0.031，2.37±0.064，2.07±0.082；在外泌體中的表達為0.14±0.007，0.07±0.019，mTOR、HDAC7在外泌體中未表達

13、。
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示，將miR-34a-5p mimic轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細胞后， MCF-7/ADR細胞及其外泌體中miR-34a-5p和NOTCH1的表達水平，與對照組相比有顯著性差異（P<0.05）。mi-34a-5p在MCF-7/ADR細胞和其外泌體中的表達分別為54.1±0.031，1.23±0.063；NOTCH1的表達分別為0.51±0.017，4.72±0.089。Western blot結(jié)果顯示

14、，將miR-34a-5p mimic轉(zhuǎn)染MCF-7/ADR細胞后，靶蛋白NOTCH1的表達明顯下調(diào)，具有顯著性差異（P<0.05）。
　　4.MTT結(jié)果顯示，與陰性對照組相比， MCF-7/ADR細胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimic后，對阿霉素的耐藥性下調(diào)，具有顯著性差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.miR-34a-5p參與調(diào)節(jié)乳腺癌細胞MCF-7對阿霉素的耐藥過程，而NOTCH1基因可能是其調(diào)控的靶基因

15、之一。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimic能夠有效上調(diào)miR-34a-5p在乳腺癌細胞MCF-7/ADR中的表達，同時引起NOTCH1蛋白在細胞的表達顯著下降，并且能夠提高細胞對阿霉素的敏感性。
　　3.與MCF-7細胞相比，miR-34a-5p在MCF-7/ADR細胞中表達顯著降低，而在ADR/exo中表達顯著升高，提示細胞耐藥性的產(chǎn)生，部分原因可能是因為耐藥細胞中miR-34a-5p可以被外泌體包裹并排出細胞外