miR-21體外轉(zhuǎn)染神經(jīng)元方案優(yōu)化及其在體外TBI模型中神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究首先通過在不同轉(zhuǎn)染條件下，包括不同的轉(zhuǎn)染溶劑、預(yù)處理和轉(zhuǎn)染試劑濃度，對(duì)miR-21在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)水平和神經(jīng)元損傷的檢測，建立一種穩(wěn)定、高效，并且對(duì)神經(jīng)元損傷較小的轉(zhuǎn)染方案。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染體外神經(jīng)元，并通過TBI模型來檢測miR-21在TBI過程中是否發(fā)揮抗凋亡作用并探索其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的研究和顱腦創(chuàng)傷的臨床基因治療提供理論依據(jù)
　　方法：神經(jīng)元取自24小時(shí)的Wistar乳鼠，培養(yǎng)7天。標(biāo)記FAM的miR-21

2、 Agomior用于檢測miR-21是否可以轉(zhuǎn)染進(jìn)入神經(jīng)元。神經(jīng)元隨機(jī)分為5組：饑餓-DMEM（S-DMEM）組、非饑餓-DMEM（N-DMEM）組、饑餓-Neurobasal（S-Neurobasal）組和非饑餓-Neurobasal（N-Neurobasal）組和空白對(duì)照組（Sham）。miR-21 oligomers（20μM，2.5μl）與RNAiMAX(0.5/1/1.5/2/2.5μl)融合后，加入DMEM或Neurobas

3、al-A使轉(zhuǎn)染液達(dá)到500μl或250μl。饑餓組在轉(zhuǎn)染前，僅加入250μlDMEM或Neurobasal行饑餓1小時(shí)。然后將轉(zhuǎn)染液加入各組的到6孔板中轉(zhuǎn)染6小時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行下一步的試驗(yàn)分析。miR-21在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)通過RT-PCR及miR-21靶基因PTEN和PDCD4的表達(dá)情況來檢測。同時(shí)為了避免miR-21的生物學(xué)作用對(duì)神經(jīng)元損傷的影響，將miR-21 agomir更換為miR-21 negative control

4、后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，通過TUNEL凋亡試劑盒和MTT試驗(yàn)檢測神經(jīng)元損傷情況。按照上述轉(zhuǎn)染方案，將FAM標(biāo)記的miR-21 agomir用于檢測miR-21的轉(zhuǎn)染效率。然后將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白組，TBI組，TBI+miR-21 agomir(TBI-A)組, TBI+miR-21 antagomir(TBI-AN)組和TBI+miR-21 negative control(TBI-NC)組。miR-21 agomir, miR-21 an

5、tagomir和miR-21 negative control按相應(yīng)組進(jìn)行轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，除空白組外，分別進(jìn)行劃痕損傷。劃痕損傷后24小時(shí)，各組神經(jīng)元內(nèi)miR-21和PTEN表示水平通過RT-PCT檢測；各組神經(jīng)元的凋亡情況通過TUNEL和MAP-2熒光雙染檢測。Western Blot檢測PTEN、總AKT、p-AKT，以及其下游凋亡相關(guān)蛋白caspase-9、cleavaged caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)情況

6、。
　　結(jié)果：FAM-miR-21可以轉(zhuǎn)染進(jìn)入神經(jīng)元。miR-21在 Neurobasal組中比DMEM組中表達(dá)明顯升高，同時(shí)RANiMAX在1.5μl時(shí)，miR-21的表達(dá)水平達(dá)到最高峰，繼續(xù)增加RANiMAX劑量沒有增高miR-21的表達(dá)水平。同時(shí)神經(jīng)元損傷具有條件依賴性和劑量依賴性，饑餓組凋亡細(xì)胞相對(duì)于非饑餓組明顯增加，同時(shí)相對(duì)于RNAiMAX: miR-21=4/5:5，RNAiMAX: miR-21=1/2/3:5的凋亡

7、神經(jīng)元明顯減少。隨后的試驗(yàn)證明，劃痕損傷的神經(jīng)元引起TBI中相似的凋亡情況，并且miR-21 agomir/antagomir可以上調(diào)/下調(diào)神經(jīng)元中miR-21的表示水平。同時(shí)，TUNEL結(jié)果顯示：miR-21減少TBI損傷中TUNEL陽性細(xì)胞。對(duì)PTEN-AKT通路檢測發(fā)現(xiàn)：miR-21降低 PTEN的基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，并且使p-KAT表達(dá)水平升高。Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：miR-21減少caspa

8、se-9、cleavaged caspase-3和Bcl-2表達(dá)，而增加Bax在神經(jīng)元中的表達(dá)。
　　結(jié)論：miR-21轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的方案是以Neurobasal-A為溶劑，不經(jīng)過饑餓處理，在miR-21 agomir：RNAiMAX=3:5的比例下進(jìn)行轉(zhuǎn)染；同時(shí)通過上調(diào)或者下調(diào)神經(jīng)元中miR-21表示水平發(fā)現(xiàn)，miR-21可以減少體外TBI模型中神經(jīng)元的凋亡，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是通過作用于PTEN-AKT通路，調(diào)節(jié)下游相關(guān)