糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞線粒體鈣運(yùn)動(dòng)變化的研究.pdf

1、本課題擬采用熒光探針Fluo-3和Rhod-2標(biāo)記新鮮分離的16周糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡掃描技術(shù)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)胞漿鈣和線粒體鈣運(yùn)動(dòng)變化情況，研究糖尿病情況下線粒體鈣調(diào)控的異常變化。 研究方法： 將180-230g的wistar雄性的大鼠隨機(jī)分為糖尿病組和對(duì)照組，糖尿病組一次性腹腔內(nèi)注射STZ誘導(dǎo)成糖尿病模型，對(duì)照組腹腔內(nèi)注射等劑量的溶劑。16周后斷頸處死大鼠，取出胸主動(dòng)脈，二步酶消化法新鮮分

2、離獲取胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)。采用新一代Ca<'2+>熒光探針Fluo-3和Rhod-2分別標(biāo)記VSMC的胞漿鈣([Ca<'2+>]i)和線粒體鈣([Ca<'2+>]m)，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡掃描技術(shù)實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)[Ca<'2+>]i和[Ca<'2+>]m運(yùn)動(dòng)變化情況，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：(1)比較糖尿病組和對(duì)照組KCl誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流和phe/Ryanodine觸發(fā)的Ca<'2+>釋放與Ca<'2+>內(nèi)流對(duì)線粒體Ca<'2+>濃度

3、的影響；(2)采用線粒體解偶劑CCCP抑制線粒體鈣攝取，比較糖尿病組和對(duì)照組CCCP對(duì)KCl誘導(dǎo)的Ca<'2+>內(nèi)流和對(duì)TG觸發(fā)的鈣池操縱性鈣內(nèi)流的影響。 研究結(jié)果： 1．STZ誘導(dǎo)糖尿病模型成功，糖尿病大鼠出現(xiàn)多飲，多食，多尿，體重增長(zhǎng)緩慢，血糖水平高等典型癥狀。 2．采用二步酶消化法可獲得較多的VSMC，顯微鏡下可見細(xì)胞呈棒狀、曲棍狀、長(zhǎng)條形或圓形，折光度強(qiáng)。采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞活性，測(cè)得活細(xì)胞的比率>9

4、5﹪?？挂黄交〖?xì)胞肌動(dòng)蛋白免疫組化染色顯示平滑肌細(xì)胞內(nèi)肌絲被染成褐色，證實(shí)所分離的細(xì)胞為VSMC。 3．有鈣液中，60mmol·L<'-1>KCl去極化細(xì)胞膜引起胞漿Ca<'2+>濃度升高，16周的糖尿病組明顯高于對(duì)照組；KCl誘導(dǎo)的Ca<'2+>內(nèi)流可引起線粒體Ca<'2+>濃度升高，糖尿病組也明顯高于對(duì)照組，兩組達(dá)峰時(shí)間無顯著性差異。 4．10 μ M phe可觸發(fā)Ca<'2+>釋放和胞外Ca<'2+>內(nèi)流，16周

5、的糖尿病組與對(duì)照組相比，phe觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和Ca<'2+>內(nèi)流都顯著降低，且達(dá)峰時(shí)間(TTP)明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；phe觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和Ca<'2+>內(nèi)流均可引起線粒體Ca<'2+>攝取，導(dǎo)致[Ca<'2+>]m升高。16周的糖尿病病組與對(duì)照組相比，phe觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和Ca<'2+>內(nèi)流引起的[Ca<'2+>]m升高程度明顯低于對(duì)照組，且達(dá)峰時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組。提示：糖尿病情況下，IP3途徑觸發(fā)的

6、Ca<'2+>釋放和Ca<'2+>內(nèi)流明顯降低，且phe觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和內(nèi)流能引起線粒體Ca<'2+>攝取，糖尿病線粒體鈣攝取幅度和速度顯著降低。 5．1 μ M Ryanodine可觸發(fā)Ca<'2+>釋放和胞外Ca<'2+>內(nèi)流，16周的糖尿病病組與對(duì)照組相比，Ryanodine觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和Ca<'2+>內(nèi)流都顯著降低，且達(dá)峰時(shí)間(TTP)明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；Ryanodine觸發(fā)的Ca<'2+>

7、釋放和Ca<'2+>內(nèi)流均可引起線粒體Ca<'2+>攝取，導(dǎo)致[Ca<'2+>]m升高。16周的糖尿病病組與對(duì)照組相比，Ryanodine觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和Ca<'2+>內(nèi)流引起的[Ca<'2+>]m升高程度明顯低于對(duì)照組，且達(dá)峰時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組。提示：糖尿病情況下，Ryanodine途徑觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和Ca<'2+>內(nèi)流明顯降低，且Ryanodine觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和內(nèi)流能引起線粒體Ca<'2+>攝取，糖尿

8、病線粒體鈣攝取幅度和速度顯著降低。 6．線粒體解偶劑CCCP能引起[Ca<'2+>]i升高，糖尿病組[Ca<'2+>]i升高程度明顯高于對(duì)照組，即從糖尿病線粒體釋放的Ca<'2+>多于對(duì)照組，提示線粒體存在鈣超載；比較線粒體解偶劑CCCP使用前后KCl引起的胞漿Ca<'2+>濃度的變化，發(fā)現(xiàn)使用CCCP后對(duì)照組KCl引起的[Ca<'2+>]i升高程度顯著降低(P<0.05)，而糖尿病組雖有降低的趨勢(shì)，但無顯著性差異，即糖尿病情況

9、下線粒體對(duì)KCl誘導(dǎo)的Ca<'2+>內(nèi)流的影響減小，提示線粒體參與KCl引起的[Ca<'2+>]i的升高過程，糖尿病線粒體鈣緩沖能力下降。 7．無鈣液中，TG耗竭鈣池后，使用線粒體解偶劑CCCP能引起[Ca<'2+>]i升高，糖尿病組[Ca<'2+>]i升高程度明顯高于對(duì)照組，即從糖尿病線粒體釋放的Ca<'2+>多于對(duì)照組，提示糖尿病線粒體存在著鈣超載；比較線粒體解偶劑CCCP使用前后TG觸發(fā)的Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+

10、>內(nèi)流的變化，發(fā)現(xiàn)使用CCCP后對(duì)照組TG觸發(fā)的[Ca<'2+>]i升高程度顯著降低(P<0.05)；而糖尿病組雖有降低的趨勢(shì)，但無顯著性差異，可見糖尿病情況下線粒體對(duì)TG觸發(fā)的Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流的影響減小，提示：線粒體參與TG觸發(fā)的Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流過程，且糖尿病線粒體鈣緩沖能力。未使用CCCP時(shí)，糖尿病組TG觸發(fā)的Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流顯著低于對(duì)照組，而CCCP使用后兩組

11、相比無顯著性差異，提示：線粒體在Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流過程中發(fā)揮重要作用，糖尿病線粒體鈣緩沖能力下降是導(dǎo)致糖尿病Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流降低的主要。 研究結(jié)論： 1．在糖尿病血管平滑肌細(xì)胞KCI去極化介導(dǎo)的[Ca<'2+>]i升高明顯高于對(duì)照組，且KCI在引起[Ca<'2+>]i升高的同時(shí)，也可引起[Ca<'2+>]m升高，糖尿病組也明顯高于對(duì)照組。 2．phe/Ryanodin

12、e能觸發(fā)經(jīng)由IP3/Ry受體途徑的Ca2+釋放和胞外Ca2+內(nèi)流，糖尿病組[Ca<'2+>]i升高的幅度和速度明顯低于對(duì)照組；phe/Ryanodine觸發(fā)的Ca<'2+>釋放和Ca<'2+>內(nèi)流可引起[Ca<'2+>]m升高，糖尿病組[Ca<'2+>]m升高的幅度和速度明顯也低于對(duì)照組。 3．線粒體解偶劑CCCP可降低KCl去極化誘導(dǎo)的Ca<'2+>內(nèi)流以及TG觸發(fā)的Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流的幅度和速度，糖尿病

13、組降低的幅度明顯低于對(duì)照組，即糖尿病情況下(2CCP對(duì)KCl誘導(dǎo)的Ca<'2+>內(nèi)流/TG觸發(fā)的Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流的影響減小，提示線粒體參與KCl誘導(dǎo)的Ca<'2+>內(nèi)流/TG觸發(fā)Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流過程，糖尿病線粒體鈣緩沖能力下降。 4．未使用CCCP時(shí)，糖尿病組TG觸發(fā)的Ca<'2+>池操縱性Ca<'2+>內(nèi)流顯著低于對(duì)照組，而CCCP使用后，兩組相比無顯著性差異，提示：線粒體在Ca