鹽酸小檗堿對(duì)2型糖尿病大鼠血管平滑肌細(xì)胞作用的研究.pdf

1、目的:觀察不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)2型糖尿病大鼠VSMCs增殖、遷移以及對(duì)TGF-β1、IL-6、TNF-α濃度的影響,從細(xì)胞、分子水平探討鹽酸小檗堿對(duì)2型糖尿病血管病變的防治作用及機(jī)制。方法:(1)造模:取體重為200±20g雄性SD大鼠30只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)選取10只大鼠作為對(duì)照組,剩余20只為模型組,對(duì)照組常規(guī)飲食,模型組高脂高糖飲食1月后腹腔以25mg/kg注射STZ,繼續(xù)高脂高糖喂養(yǎng)1月,以空腹血糖大于7.0mmol/L、

2、餐后2小時(shí)血糖大于11.1mmol/L并伴有胰島素敏感指數(shù)的下降為成模鼠；(2)VSMCs的培養(yǎng)鑒定:組織塊貼壁法培養(yǎng)正常和2型糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈中膜VSMCs,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、計(jì)數(shù)法觀察VSMCs生長(zhǎng)曲線、α-SM actin免疫組化染色鑒定VSMCs;(3)檢測(cè)指標(biāo):取4-6代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常和2型糖尿病大鼠VSMCs懸液分別接種于96孔板中,正常大鼠VSMCs為正常組,加入無(wú)血清DMEM,糖尿病大鼠VSMCs隨機(jī)分為模型組

3、、陽(yáng)性對(duì)照組、治療組1-治療組5,各組所加藥物及最終藥物濃度依次為:無(wú)血清DMEM、50μg/ml的卡托普利、100、50、25、12.5、6.25μg/ml的鹽酸小檗堿。檢測(cè)不同濃度鹽酸小檗堿對(duì)2型糖尿病大鼠VSMCs增殖的影響(CCK-8試劑盒)、遷移的影響(細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn))、對(duì)VSMCs培養(yǎng)液中TGF-β1、IL-6、TNF-α濃度的影響(ELISA法)。結(jié)果:(1)造模成功:模型組大鼠體重262.11±18.35g較正常組350.

4、56±19.74g明顯降低(P<0.01)、空腹血糖15.82±2.44mmol/L較正常組5.23±0.74 mmol/L明顯增加(P<0.01)、餐后2小時(shí)血糖23.78±2.23mmol/L較正常組7.23±1.31mmol/L明顯增加(P<0.01)、血胰島素水平32.59±3.12μIU/ml較正常組54.38±4.97μIU/ml明顯增加(P<0.01)、胰島素敏感指數(shù)-6.37±0.43較正常組-4.16±0.39降低(P

5、<0.05)。(2)鑒定:在倒置相差顯微鏡下觀察單個(gè)正常大鼠VSMCs呈細(xì)長(zhǎng)梭形、三角形,扇形,或者不規(guī)則形,局部細(xì)胞平行排列呈束,細(xì)胞部分區(qū)域呈多層重疊生長(zhǎng),高低起伏呈現(xiàn)典型“峰-谷”狀；糖尿病VSMCs胞漿豐富,生長(zhǎng)更為致密,平行排列成束,交織成網(wǎng),多重疊生長(zhǎng)成旋渦狀；培養(yǎng)第4-6代的糖尿病VSMCs經(jīng)特異的平滑肌α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色后呈陽(yáng)性反應(yīng),高倍鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)大量棕色、與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲,即平滑肌α-肌動(dòng)蛋白絲

6、；正常和糖尿病大鼠VSMCs生長(zhǎng)曲線近似“s”形,前三天增殖較旺盛,呈指數(shù)速度生長(zhǎng),3-5天生長(zhǎng)速度減慢,但細(xì)胞數(shù)目仍穩(wěn)步增加,5-7天細(xì)胞開(kāi)始衰亡。糖尿病大鼠VSMCs生長(zhǎng)速度明顯高于正常大鼠VSMCs生長(zhǎng)速度。(3)檢測(cè)指標(biāo):①增殖的影響:正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組吸光度A值分別為0.307±0.025、0.617±0.033、0.465±0.032,治療組1-5吸光度A值分別為0.352±0.023、0.399±0.029、0.4

7、52±0.032、0.505±0.035、0.531±0.044,不同濃度鹽酸小檗堿均可對(duì)正常和糖尿病大鼠VSMCs的增殖產(chǎn)生抑制作用,且隨鹽酸小檗堿的濃度增加,抑制作用增強(qiáng)。治療1、2組對(duì)糖尿病大鼠VSMCs增殖產(chǎn)生的抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；②遷移的影響:用Transwell小室法檢測(cè)不同濃度鹽酸小檗堿作用48h后穿膜細(xì)胞數(shù)分別為19.20±1.15、21.27±1.28、25.33±1.95、30

8、.67±1.72、40.00±1.65個(gè)/高倍視野,各組穿膜細(xì)胞數(shù)均少于模型組48.33±2.38個(gè)/高倍視(P<0.01),說(shuō)明各濃度鹽酸小檗堿對(duì)糖尿病VSMCs的遷移均有抑制作用；③TGF-β1、IL-6、TNF-α的影響:模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及各治療組VSMCs培養(yǎng)液中TGF-β1濃度依次為22.54±2.96、18.55±2.85、14.56±1.60、15.67±1.10、18.18±2.82、19.12±1.92、20.17±

9、1.73ng/ml,明顯高于正常組10.96±1.48 ng/ml(P<0.05)；模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及各治療組VSMCs培養(yǎng)液中IL-6濃度濃度依次為469.47±20.47、401.66±20.01、303.51±15.50、340.56±18.60、382.19±17.99、421.62±22.37、451.15±23.57pg/ml,明顯高于正常組257.34±17.0pg/ml(P<0.05),模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及除治療組1外

10、各治療組大鼠VSMCs中TNF-α濃度依次為2.15±0.30、1.59±0.22、1.27±0.30、1.51±0.18、1.65±0.33、1.89±0.13ng/ml,明顯高于正常組0.86±0.20ng/ml(P<0.05)。除治療組5外,各治療組濃度鹽酸小檗堿均可明顯減小糖尿病大鼠VSMCs中TGF-β1、IL-6、TNF-α濃度,與模型組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:鹽酸小檗堿可以抑制糖尿病VSMCs的增殖