JAK-STAT信號通路在胰彈性蛋白酶誘導大鼠Kupffer細胞分泌促炎因子中的作用.pdf

1、急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是一種多系統(tǒng)疾病，是臨床常見急腹癥之一，不但累及胰腺，而且累及肝、肺、腎臟等器官，早期死亡的主要原因是AP合并多器官功能衰竭，其住院病人死亡率高達25%。由于胰腺血液在回流心臟前需經(jīng)過肝臟的代謝和處理，而肝臟的Kupffer細胞（Kupffercell，KC）占整個單核巨噬細胞系統(tǒng)的80%～90%，是體內(nèi)最大的固定巨噬細胞群，因此肝臟是AP最常累及的胰外器官之一，其對AP的病情發(fā)展

2、也有重要影響。而且，肝功能損害已被認為是判斷AP嚴重程度的重要指標，已作為獨立的指標合并進了預測AP嚴重程度的Ranson評分和急性生理慢性健康評估Ⅱ（Acute Physiological Chronic Health EvaluationⅡ，APACHE Ⅱ）系統(tǒng)，對預測AP臨床預后尤為重要。 關(guān)于AP時并發(fā)多器官功能不全綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的發(fā)病機制存在

3、眾多理論，除胰酶異常激活、微循環(huán)障礙、腸道細菌易位、內(nèi)毒素血癥及二次打擊學說外，炎癥介質(zhì)過度表達理論目前已經(jīng)成為又一研究難點及熱點。許多研究表明炎癥因子在AP的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。在細胞水平，細胞因子的作用能被協(xié)同，拮抗或互補，表明在促炎和抗炎刺激下存在復雜的相互作用。AP時，胰腺腺泡細胞凋亡、胰酶大量釋放，胰酶及胰腺壞死產(chǎn)物迅速誘導氧自由基釋放，活化核因子-kappaB（NF-kB），并隨之產(chǎn)生大量促炎細胞因子如TNF-α，IL

4、-1，IL-6及IL-18等，引起細胞黏附分子上調(diào)和白細胞活化以及許多其他遞質(zhì)爆發(fā)等一系列連鎖和放大反應(yīng)，這些細胞因子的大量釋放，各種效應(yīng)細胞活化，最終導致全身炎癥反應(yīng)綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS）以及MODS。 JAK/STAT（Janus Kinases/signal transducers and activators of transcription）

5、信號通路途徑最初是在1994年，Darnell等進行干擾素（IFN-α和IFN-γ）對細胞的作用機制研究時發(fā)現(xiàn)的，它代表的是一條極其快速的從細胞外到細胞核的信號轉(zhuǎn)導通路，環(huán)節(jié)少而簡潔。多種細胞因子可與細胞表面受體結(jié)合，誘導受體二聚化，并通過酪氨酸磷酸化作用激活JAK，活化的JAKS可使受體的酪氨酸結(jié)合位點磷酸化，當細胞受到信號刺激時，SH2結(jié)構(gòu)域與受體上磷酸化的酪氨酸殘基相結(jié)合，磷酸化的STATS從受體上解離下來進入核內(nèi)，與DNA靶序列

6、特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因表達，完成細胞因子介導的信號轉(zhuǎn)導全過程。近年來有有研究表明，JAK/STAT信號通路參與了多種重要致炎、抗炎細胞因子的信號轉(zhuǎn)導及調(diào)控過程，尤其以IFN-r、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10以及近年新發(fā)現(xiàn)的促炎癥因子IL-18與JAK/STAT信號通路活化關(guān)系密切。業(yè)已明確，IFN-r是膿毒癥時重要的炎癥介質(zhì)，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）合并IFN-r攻擊時小鼠致死率明顯升高，其

7、原因可能與IFN-r活化JAK/STAT信號通路有關(guān)。然而，關(guān)于JAK/STAT信號通路在AP大鼠肝臟KC分泌促炎性因子中的作用，目前尚無研究報道。 基于此，本研究將通過體外實驗建立AP模型，利用ELISA、細胞免疫熒光技術(shù)、Western blot等技術(shù)研究實驗性AP大鼠肝臟KC中JAK/STAT活化、TNF-α、IL-6及IL-18的表達，并通過JAK2特異性抑制劑AG490進行干預性研究，選擇性地阻斷JAK從而阻斷JAK/

8、STAT信號轉(zhuǎn)導闡明JAK/STAT信號通路、細胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的相互作用關(guān)系及調(diào)控機制，以從分子水平闡明AP肝損傷的發(fā)病機制，為AP臨床治療提供一個新的思路。 目的: 以AP肝損傷作為研究對象，通過原代細胞培養(yǎng)對肝臟KC表達的炎癥細胞因子在JAK2/STAT信號通路中的作用，以及JAK2抑制劑對AP肝損傷的保護作用，以期對AP病程中胰外器官損傷發(fā)生率高、病死率高的原因，及其與SIRS之間的相互關(guān)系進行初步探討，為臨床最終

9、達到提高AP療效、減少AP并發(fā)癥、降低其病死率提供理論和實驗依據(jù)。 材料和方法: 健康雄性SD大鼠24只（200～250g），購自南京軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心。本實驗按采用改進了的酶消化、密度梯度離心以及選擇貼壁法提取KC。將提取的KC接種于6孔板中（1×10/ml），1h后去除培養(yǎng)基，再用溫PBS清洗2遍，去除未貼壁細胞，貼壁細胞即為實驗所需的高純度的KC，繼續(xù)用10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，按

10、隨機數(shù)字表隨機分成細4組，A組：在培養(yǎng)基上清液中加入生理鹽水（30ul/ml）作為正常對照組；B組：上清液LPS（50ng/ml）處理組；C組：LPS（50ng/ml）和elastase（1U/ml）處理組；D組：AG490預處理組：AG490（30nmol/ml）預先刺激0.5h后，再用LPS（50ng/ml）和elastase（1U/ml）處理，每組設(shè)4個復孔。各組細胞置于相同條件下培養(yǎng)，12h后收集培養(yǎng)基，4℃，10000×g離心

11、10min，取上清液并立即凍于-70℃保存；同時收集KC，提取蛋白并定量。分別用ELISA試劑盒檢測細胞上清液IL-6、IL-18和TNF-α含量和用細胞免疫熒光技術(shù)和Western blotting法檢測細胞總蛋白中JAK2的表達情況。 本研究所有計量資料以均數(shù)士標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS13.0軟件，計量資料采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: 1.A、B、C、D四

12、組總的比較，差異有統(tǒng)計學差異（P=0.000）。與A組比較，B組TNF-α，IL-6和IL-18含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計學差異（P=0.000）；與B組比較，C組TNF-α，IL-6和IL-18含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計學差異（P=0.000）；與C組比較，D組TNF-α，IL-6和IL-18含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學差異（P=0.000），但與B組比較僅有輕微變化，差異均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。 2.熒光顯微鏡下觀察細

13、胞發(fā)綠色熒光情況。未作處理的KC未檢測到熒光染色的細胞；B組可見JAK2表達微弱；給與LPS和elastase處理后，JAK2表達上調(diào)；D組給與AG490預處理后，JAK2表達明顯下調(diào)。 3.各實驗組和對照組KC中均有JAK2表達。A、B、C、D四組總的比較，差異有統(tǒng)計學差異（P=0.000）。給與LPS刺激后，JAK2含量與對照組比較增加，差異有統(tǒng)計學差異（P=0.000）；同時給予LPS和elastase刺激后，與B組相比較

14、JAK2含量增加，差異有統(tǒng)計學差異（P=0.000）；給予AG490預處理后，JAK2含量與C組比較減少，差異有統(tǒng)計學差異（P=0.000），但與B組比較僅有輕微變化，差異無統(tǒng)計學差異（P=0.928）。 主要結(jié)論: 1.AP病程中，KC在炎癥反應(yīng)放大、胰外器官損傷中起著重要的作用。 2.KC受到胰彈性蛋白酶等胰酶及LPS的刺激后誘導炎癥因子的大量表達，激活JAK2/STAT信號通路，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程中

15、發(fā)揮著重要作用，可能是導致SIRS和高MODS發(fā)生率、高病死率的原因。 3.胰彈性蛋白酶等胰酶刺激KC后，IL-6、IL-18和TNF-α等炎癥因子的表達顯著增加，這表明AP病程中炎癥反應(yīng)較其它疾病更易被異常放大的原因可能與胰彈性蛋白酶等胰酶的存在和大量釋放有關(guān)。 4.AG490可顯著減少胰彈性蛋白酶等胰酶及LPS的刺激后誘導的炎癥因子的產(chǎn)生，其可能是通過抑制JAK2的活化，有效阻斷其下游信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)導激活子STAT的活