

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、目的:
周圍神經(jīng)損傷是臨床常見的致殘性疾病,發(fā)病率呈逐年增高的趨勢。本研究以ADSCs為種子細胞的源泉,將其在多因子的聯(lián)合作用下誘導分化為施萬樣細胞,以ANA為支架構建組織工程神經(jīng),橋接大鼠缺損的坐骨神經(jīng),觀察損傷神經(jīng)順向軸漿運輸?shù)陌衅鞴佟枘c肌中運動終板(Motor end plate,MEP)形態(tài)、數(shù)量以及乙酰膽堿酯酶(AchE)的含量;檢測逆向軸漿運輸?shù)陌衅鞴佟顾韬图股窠?jīng)節(jié)中神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF、CNTF和NGF)及
2、JAK/STAT通路中P-JAK2/JAK2和P-STAT3/STAT3的表達,應用JAK抑制劑AG490后,再次檢測各因子的表達。從而闡明周圍神經(jīng)再生修復的分子機制,完善相關的理論,為周圍神經(jīng)損傷的臨床康復治療提供重要的實驗基礎和理論依據(jù)。
方法:
一、ADSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
(一)分離、培養(yǎng)
雄性Wistar大鼠,體重100±20 g,無菌條件下切取附睪旁脂肪組織,酶法消化脂肪組織后進行
3、ADSCs培養(yǎng),待貼壁細胞約鋪滿瓶底80%時,進行傳代培養(yǎng)。
?。ǘ╄b定:選擇第4代ADSCs對其進行鑒定
1、采用油紅O和茜素紅染色檢測ADSCs的多向分化能力。
2、采用流式細胞術檢測細胞表面分子:CD29、CD44、CD49、CD45、CD31及CD106。
二、ADSCs誘導分化為施萬樣細胞及施萬樣細胞的鑒定
1、取第4代ADSCs,在誘導因子的作用下向SC定向誘導分化。
4、 2、分別采用免疫熒光、Western Blotting和Real-time PCR從蛋白和基因水平檢測SC特異性標志物GFAP、S-100和P75的表達。
3、采用MTT實驗檢測施萬樣細胞的增殖能力。
三、組織工程神經(jīng)構建
1、雄性Wistar大鼠,體重200-250 g,10%水合氯醛麻醉大鼠,無菌條件下切取雙側坐骨神經(jīng),長約為15mm。參照劉承吉等低滲—除垢劑法制備ANA,作為組織工程神經(jīng)的支架。<
5、br> 2、應用PKH-26熒光染料標記ADSCs和施萬樣細胞。
3、將標記后的ADSCs及施萬樣細胞按1×106/ml的接種密度從ANA的一端注入,置于含有相應培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后備用。
四、動物分組與坐骨神經(jīng)損傷模型制備及橋接操作
1、實驗動物分組
120只雄性Wistar大鼠(體重200-250 g,購自中國醫(yī)科大學實驗動物部)隨機分為正常對照組、DMEM組(支架內(nèi)單
6、純注射細胞培養(yǎng)基)、ADSC組(支架內(nèi)注射ADSCs懸液)、SC組(支架內(nèi)注射施萬樣細胞懸液)和AG組(同SC組,指標檢測前72 h給與AG490進行干預)。
2、手術操作
無菌條件下,各組分別用相應的組織工程神經(jīng)橋接于大鼠損傷神經(jīng)的兩斷端處,手術顯微鏡下端-端縫合神經(jīng)外膜,抗生素沖洗創(chuàng)面,縫合肌肉及皮膚。
結果:
一、ADSCs具有干細胞的特征
倒置顯微鏡下觀察ADSCs呈多邊形、長梭
7、形,團簇狀生長。ADSCs具有成脂和成骨分化能力,并且細胞表面分子CD29(+)、CD44(+);CD49(-)、CD45(-)、CD31(-)、CD106(-)。以上結果揭示ADSCs具有干細胞的特性。
二、ADSCs誘導分化為施萬樣細胞并鑒定
誘導初期,細胞體積減小、立體感增強,部分細胞胞體收縮成梭形,兩側有對稱生長的細長突起。10-12 d后胞體繼續(xù)收縮呈梭形,排列成柵欄樣,可見細長的突起,且互相吻合成網(wǎng)。We
8、stern Blotting、免疫熒光和Real-time PCR結果顯示,幾乎所有分化細胞均表達GFAP、S100和p75,類似于真正的SC。
三、施萬樣細胞具有較強的有絲分裂增殖能力
MTT實驗顯示在誘導分化的第1-3 d細胞生長緩慢,3d以后細胞迅速增殖并持續(xù)到第7d,第9-11 d細胞仍處于增殖狀態(tài),但增殖速度卻有所下降。同時,倒置顯微鏡下可見施萬樣細胞的有絲分裂現(xiàn)象。
四、PKH-26熒光追蹤AD
9、SCs和施萬樣細胞
免疫熒光結果顯示術后12 W可見PKH-26標記的細胞發(fā)出紅色熒光信號,說明ADSCs和施萬樣細胞于術后12W仍存活于宿主體內(nèi)。
五、施萬樣細胞聯(lián)合州A具有明顯促進坐骨神經(jīng)功能恢復的作用
?。ㄒ唬┥窠?jīng)電生理檢測評估坐骨神經(jīng)的功能恢復情況
術后6W,AG組和SC組坐骨神經(jīng)傳導速度和波幅明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.05)。術后12W,各組間表達趨勢同術后6W,且AG組神經(jīng)
10、電生理參數(shù)改善程度要優(yōu)于其他組(P<0.05)。
?。ǘ╇婄R觀察再生神經(jīng)纖維的超微結構
AG組和SC組再生神經(jīng)纖維超微結構明顯優(yōu)于DMEM組和ADSC組,表現(xiàn)為:髓鞘結構較規(guī)整、髓鞘較厚且厚度均一。
(三)AchE染色觀察腓腸肌MEP形態(tài)、數(shù)量及分析AchE光密度值
光鏡下,正常對照組腓腸肌MEP AchE染色呈紅棕色,圓形或橢圓形,著色均勻。術后6W,AG組和SC組MEP形態(tài)較規(guī)整、數(shù)量以及Ac
11、hE光密度值均明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.05)。術后12W,各組間比較趨勢同術后6W,且AG組MEP數(shù)量增多,AchE光密度值明顯升高(P<0.05)。
六、施萬樣細胞結合ANA促進坐骨神經(jīng)再生修復的機制
(一)Western Blotting檢測BDNF、CNTF、NGF、JAK2、P-JAK2、STAT3和P-STAT3蛋白的表達。
1、在脊髓
(1)術后6W,AG組和SC組患側
12、脊髓內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達量明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.01),且AG組上述三蛋白表達量高于SC組(P<0.01),接近于正常對照組(P>0.05)。術后12W,各組間BDNF、CNTF和NGF蛋白表達趨勢同術后6W,表達量高于術后6W(P<0.05)。
(2)術后6W,患側脊髓內(nèi)JAK2蛋白在組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而對于P-JAK2和STAT3/P-STAT3蛋白,AG組和SC
13、組表達量明顯低于DMEM組和ADSC組(P<0.01);且AG組低于SC組(P<0.01)。術后12W,除外JAK2蛋白在AG組、SC組、DMEM組和ADSC組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); AG組STAT3蛋白的表達量明顯升高(P>0.05),其他表達趨勢同術后6W。
2、在脊神經(jīng)節(jié)
(1)術后6W,AG組和SC組患側脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達量明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.
14、01),低于正常對照組(P<0.05);且AG組上述三蛋白表達量高于SC組(P<0.01)。術后12W,除AG組BDNF蛋白表達量接近于正常對照組水平外(P>0.05);其他表達趨勢同術后6W。
(2)術后6W,AG組和SC組患側脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)JAK2和P-JAK2蛋白的表達量明顯低于DMEM組和ADSC組(P<0.05);且AG組低于SC組(P<0.05)。術后12W,JAK2蛋白表達在各組間差別無統(tǒng)計學意義,P-JAK2蛋白表
15、達趨勢同術后6W。
(二)免疫熒光化學染色顯示BDNF、CNTF、NGF、P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達。
1、在脊髓
(1)術后6W,AG組和SC組患側脊髓內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達量明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.01),且AG組接近于正常對照組(P>0.05)。術后12W,BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達趨勢同術后6W。
(2)術后6W,AG組患側脊髓內(nèi)P-J
16、AK2和P-STAT3蛋白的表達量低于DMEM組、ADSC組和SC組(P<0.05)。術后12W,除AG組P-JAK2蛋白的表達量接近于正常對照組外(P>0.05),其他差異趨勢同術后6W。
2、在脊神經(jīng)節(jié)
(1)術后6W,AG組和SC組患側脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達量明顯高于DMEM組和ADSC組(P<0.01),但低于正常對照組(P<0.01);且AG組表達量高于SC組(P<0.05)。術后1
17、2W,BDNF、CNTF和NGF蛋白的表達趨勢同術后6W。
(2)術后6W,AG組患側脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)P-JAK2和P-STAT3蛋白的表達量低于DMEM組、ADSC組和SC組(P<0.05),但高于正常對照組(P<0.05)。術后12W,除AG組P-STAT3蛋白的表達量接近于正常對照組外(P>0.05),其他差異趨勢同術后6W。
結論:
1、ADSCs能成功誘導分化為施萬樣細胞,表達SC標記物。
2
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 種植施萬細胞的脫細胞同種異體神經(jīng)移植物修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗研究.pdf
- 脫細胞神經(jīng)支架復合骨髓間充質(zhì)細胞修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損.pdf
- 預防大鼠坐骨神經(jīng)修復中瘢痕粘連及促進神經(jīng)再生的作用研究.pdf
- AMPA受體在大鼠坐骨神經(jīng)再生中作用機制的實驗研究.pdf
- 脫細胞處理的同種異體神經(jīng)修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實驗研究.pdf
- 復合GDNF和VEGF質(zhì)粒的異體脫細胞神經(jīng)支架對大鼠坐骨神經(jīng)缺損的修復作用.pdf
- 關于坐骨神經(jīng)再生的機理.pdf
- 川芎嗪預處理促進大鼠坐骨神經(jīng)異體移植后神經(jīng)再生.pdf
- 免疫抑制對大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復后神經(jīng)再生的實驗研究.pdf
- JAK-STAT信號通路在微波輻照致小膠質(zhì)細胞活化中的作用.pdf
- 小間隙吻合術結合控釋生長因子促進大鼠坐骨神經(jīng)再生實驗研究.pdf
- 艾灸調(diào)控RA滑膜細胞功能的JAK-STAT信號通路負反饋機制研究.pdf
- 表皮神經(jīng)嵴干細胞修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損.pdf
- 人參皂苷Re促進坐骨神經(jīng)損傷后周圍神經(jīng)再生的機制研究.pdf
- 骨髓基質(zhì)干細胞復合去細胞神經(jīng)修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損及其機制的初步研究.pdf
- 物理因子對脫細胞同種異體神經(jīng)移植物修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損的影響.pdf
- JAK-STAT信號通路在腸道病毒71型感染THP-1細胞中的作用機制.pdf
- 小劑量超短波對種植BMSCs脫細胞支架修復大鼠坐骨神經(jīng)損傷的作用.pdf
- EPO、IGF-1、ILK和JAK-Stat信號通路在大鼠肝再生中對肝細胞增殖的調(diào)節(jié)作用研究.pdf
- 腹腔注射ATP對大鼠坐骨神經(jīng)再生影響的實驗研究.pdf
評論
0/150
提交評論