JAK-STAT信號(hào)通路在氧化應(yīng)激預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)中的作用.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)疾病對(duì)人類健康的危害很大。中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同疾病的生理病理機(jī)制雖然各不相同，但近年的研究表明，腦缺血、腦出血、癲癇、腦外傷、缺氧性腦病，神經(jīng)系統(tǒng)變性及退行性變等神經(jīng)系統(tǒng)疾病均具有某些相似或共同的生理病理機(jī)制，均存在細(xì)胞壞死和凋亡。神經(jīng)保護(hù)已成為21世紀(jì)神經(jīng)病學(xué)研究的重點(diǎn)。 氧化應(yīng)激(oxidativestress)是指機(jī)體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生與消除失去平衡，或外源性的過量攝入，導(dǎo)致活性氧(ReactiveOxygenSpeci

2、es，ROS)在體內(nèi)堆積引起細(xì)胞毒性。ROS生成增多，可觸發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的興奮性毒性和凋亡這兩個(gè)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的主要因素。闡明氧化應(yīng)激在神經(jīng)損傷以及神經(jīng)退行性疾病中的作用，能為許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的治療措施。 第一部分H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用研究 目的：探討H2O2預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 研究方法： 1.Hochest染色檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡。 2.PI染

3、色流式細(xì)胞儀(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡。 3.MTT檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率。 研究結(jié)果： 1.H2O2損傷濃度與時(shí)間的確定： ①用100-500μmol/L的H2O2處理PC12細(xì)胞，引起PC12細(xì)胞的凋亡具有劑量依賴性的關(guān)系。②為了進(jìn)一步確定300μmol/LH2O2在24h內(nèi)對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響，我們選取了不同時(shí)間段(4h、8h、12h、18h和24h)來觀察PC1

4、2細(xì)胞的凋亡情況。 根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文選定H2O2的損傷濃度為300μmol/L，損傷時(shí)間為12h，開展以后的研究工作。 2.H202預(yù)處理濃度、時(shí)間與間隔的確定： ①H2O2預(yù)處理濃度的確定：上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的損傷具有劑量-時(shí)間依賴性的特點(diǎn)，100μmol/LH2O2對(duì)PC12細(xì)胞幾乎無損傷作用(p＞0.05)，所以選擇100μmol/L為H2O2的預(yù)處理濃度。 ②預(yù)處理時(shí)

5、間的確定：有文獻(xiàn)報(bào)道，幾次短暫的腦缺血預(yù)處理后，最強(qiáng)的腦保護(hù)作用發(fā)生在間隔24h后，因此本文選擇24h為預(yù)處理間隔，考查預(yù)處理的時(shí)間。結(jié)果顯示，100μmol/LH2O2預(yù)處理90rmin，間隔24h，可以明顯抑制由300μmol/LH2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡率由(65.83±2.06)％(44.63±3.35)％(p＜0.05)。而預(yù)處理30min、60min和120min組的凋亡率與損傷組相比，，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞

6、0.05)。因此本文確定90min為預(yù)處理時(shí)間。 ③預(yù)處理間隔的確定：上述結(jié)果表明，H2O2預(yù)處理90min，間隔24h組，細(xì)胞凋亡率為(44.63±3.35)％(p＜0.05)，可以明顯對(duì)抗300μmol/LH2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡，為進(jìn)一步確定預(yù)處理的間隔時(shí)間，本文分別觀察預(yù)處理間隔為12h和36h時(shí)，H2O2預(yù)處理抗細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果表明，預(yù)處理間隔12h組和36h組的細(xì)胞凋亡率，與損傷組相比，p＞0.05，無統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)差異。提示：100μmol/LH2O2預(yù)處理PC12細(xì)胞90min后，間隔24h能產(chǎn)生明顯的細(xì)胞保護(hù)作用。綜合以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究以100μmol/L作為H2O2的預(yù)處理濃度，90min作為H2O2的預(yù)處理時(shí)間，24h作為H2O2的預(yù)處理間隔，開展后續(xù)的研究工作。 3.H202預(yù)處理對(duì)PC12細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用： ①經(jīng)Hochest熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到，對(duì)照組PC12細(xì)胞染色質(zhì)分布均

8、勻，為彌漫均勻的低強(qiáng)度熒光；經(jīng)300μmol/LH2O2處理12h后，未經(jīng)100μmol/LH2O2預(yù)處理的PC12細(xì)胞，呈現(xiàn)出典型的凋亡特征，大量的細(xì)胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光；經(jīng)100μmol/LH2O2預(yù)處理90min的PC12細(xì)胞，能對(duì)抗由300μmol/LH2O2引起的損傷，其中細(xì)胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細(xì)胞明顯減少。100μmol/LH2O2預(yù)處理本身不引起細(xì)胞凋亡。 ②我們通過對(duì)凋亡圖譜

9、中亞二倍體峰的定量分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)300μmol/LH2O2處理12h后，未經(jīng)100μmol/LH2O2預(yù)處理的PC12細(xì)胞，其凋亡率增加到(65.80±3.20)％(p＜0.01)；經(jīng)100μmol/LH2O2預(yù)處理的PC12細(xì)胞，其凋亡率由300μmol/L組的(65.8±3.20)％降低到(44.3±3.30)％(p＜0.01)；100μmol/LH2O2預(yù)處理本身不引起細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果充分表明，H2O2預(yù)處理能夠?qū)垢邼舛菻2O2

10、誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡。 ③MTT細(xì)胞存活率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣驗(yàn)證了以上的結(jié)論。 綜合以上Hochest染色的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、FCM流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)凋亡細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及MTT對(duì)細(xì)胞存活率的檢測(cè)結(jié)果，本研究證實(shí)，100μmol/L的H2O2預(yù)處理PC12細(xì)胞90min，間隔24h，可以對(duì)抗隨后給予的高濃度(300μmol/L)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生顯著的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 結(jié)論：H2O

11、2預(yù)處理能使PC12細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷，產(chǎn)生明顯的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 第二部分JAK/STAT信號(hào)通路在H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)中的作用研究 目的：探討JAK/STAT途徑、iNOS和COX-2在氧化應(yīng)激預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)中的作用；闡明JAK/STAT途徑分別與iNOS和COX-2在氧化應(yīng)激預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用中的關(guān)系。研究方法：1.Westernblot定性定量分析各種蛋白被H2O2預(yù)處理激活的情況

12、。 2.Hochest染色檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡。 3.PI染色流式細(xì)胞儀(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡。 4.MTT檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率。 研究結(jié)果：1.JAK/STAT信號(hào)通路介導(dǎo)了H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用①100μmol/LH2O2預(yù)處理PC12細(xì)胞90min后，誘導(dǎo)了JAK2的快速表達(dá)和酪氨酸磷酸化，但沒有激活JAK1。 ②JAK2活性的上調(diào)和酪氨酸磷

13、酸化誘導(dǎo)了STAT1和STAT3的酪氨酸磷酸化以及核轉(zhuǎn)移。 ③在H2O2預(yù)處理前20min給予JAK2的特異性抑制劑AG-490(10μmol/L)，可以完全阻斷H2O2預(yù)處理對(duì)JAK/STAT通路的激活，不但阻斷了JAK2的上調(diào)和酪氨酸磷酸化，而且阻斷了STAT1和STAT3的酪氨酸磷酸化以及核轉(zhuǎn)移。 ④在H2O2預(yù)處理前20min給予JAK2的特異性抑制劑AG-490(10μmol/L)，可以阻斷H2O2預(yù)處理抗PC

14、12細(xì)胞凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用，使PC12細(xì)胞的凋亡率明顯增加，存活率減少。 以上結(jié)果充分證實(shí)，H2O2預(yù)處理能激活JAK/STAT信號(hào)通路，表明JAK/STAT信號(hào)通路參與了H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 2.JAK/STAT信號(hào)通路通過iNOS介導(dǎo)H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用：①10μmol/LH2O2預(yù)處理，可以明顯上調(diào)iNOS的表達(dá)。 ②在H2O2預(yù)處理前20min給予iNOS的特異性抑制劑A

15、G(10μmol/L)，不但可以阻斷iNOS的表達(dá)上調(diào)，而且可以取消H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用，表明iNOS參與了H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 ③進(jìn)一步的研究表明，JAK/STAT信號(hào)通路的特異性抑制劑AG-490(10μmol/L)，可以明顯抑制H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)上調(diào)(p＜0.01)。 結(jié)果表明，H2O2預(yù)處理可以激活iNOS，JAK/STAT信號(hào)通路可通過iNOS介導(dǎo)H2O2預(yù)處理的適應(yīng)

16、性神經(jīng)保護(hù)作用。 3.JAK/STAT信號(hào)通路通過COX-2介導(dǎo)H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用：①100μmol/LH2O2預(yù)處理，可以誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)顯著上調(diào)。 ②在預(yù)處理前20min給予COX-2的特異性抑制劑NS-398(10μmol/L)，不僅可以完全阻斷COX-2的表達(dá)，而且可以明顯取消H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 ③在預(yù)處理前20min給予JAK2的特異性抑制劑AG-490(10pmo

17、l/L)，可以明顯抑制由H2O2預(yù)處理誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)上調(diào)(p＜0.01)。 結(jié)果表明：H2O2預(yù)處理可以激活COX-2，JAK/STAT信號(hào)通路通過COX-2介導(dǎo)H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 結(jié)論： 1.JAK/STAT信號(hào)通路介導(dǎo)了H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 2.JAK/STAT信號(hào)通路通過iNOS介導(dǎo)了H2O2預(yù)處理的適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)作用。 3.JAK/STAT信號(hào)通路