氧化-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號途徑在弓形蟲感染致胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、背景：剛地弓形蟲能夠感染幾乎所有溫血動物,其中包括全球約30％的人口。感染通常為無癥狀的隱形感染,但是孕期弓形蟲感染可能導致流產(chǎn),死產(chǎn),以及嚴重的智力發(fā)育低下,視網(wǎng)膜或神經(jīng)損傷。雖然弓形蟲感染引起的出生缺陷可能機制包括結(jié)構(gòu)性損傷,內(nèi)分泌失調(diào),胎盤組織細胞凋亡增加等幾個方面,但目前先天性弓形蟲病的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)和確切機制仍不清楚。弓形蟲在宿主細胞可引起雙重的凋亡效應?，F(xiàn)前的一些研究表明,弓形蟲感染的細胞對凋亡刺激信號表現(xiàn)出相對的抵抗性;另一

2、方面,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)弓形蟲急性感染可誘發(fā)CD4+小鼠脾細胞凋亡。研究已經(jīng)證明,高水平的細胞凋亡、高的死亡率與高毒力弓形蟲株感染相關(guān);相比之下,在慢性弓形蟲腦炎,只觀察到有少數(shù)細胞凋亡。因此,細胞凋亡的啟動和凋亡的發(fā)展程度可能在弓形蟲病的發(fā)病機制和最終轉(zhuǎn)歸中起著關(guān)鍵作用?？傊?先天性弓形蟲病發(fā)病中的重要事件和確切機制仍不清楚。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成,折疊和組裝的主要細胞器。未折疊或錯誤折疊蛋白的積累可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)適應性反應,

3、稱為未折疊蛋白反應(UPR),最終導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)。越來越多的證據(jù)顯示,在各種毒性物質(zhì),包括活性氧(ROS),化學物質(zhì)和重金屬引起細胞凋亡的調(diào)控中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激起著關(guān)鍵的作用。氧化應激是由于ROS生成和抗氧化能力之間的不平衡,這種應激反應通過多種信號通路引發(fā)細胞凋亡,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應和ASK1/JNK的活化。在一些疾病,如糖尿病,鎘中毒和神經(jīng)退行性疾病中,這些病理過程中可同時存在。此外,有越來越多的證據(jù)表明,氧化應激在感染誘導的細

4、胞凋亡中起著重要的作用。
　　通常,由于母胎新陳代謝的需要,胎盤線粒體活動和ROS的產(chǎn)生增加,孕期處于輕度氧化應激狀態(tài)。在孕早期,由于絨毛間隙血流的建立,會在短時間誘發(fā)氧化應激;胎盤先承受缺氧,然后缺氧/復氧的過程,機體如果不具備有效的抗氧化防御的能力將可能導致早期流產(chǎn)。妊娠后期,在妊娠并發(fā)糖尿病,胎兒宮內(nèi)生長受限和先兆子癇中可發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細胞凋亡水平增加,氧化應激水平增加。以往的研究發(fā)現(xiàn),在獻血員中,弓形蟲感染可導致氧化應激和機體

5、的免疫抑制。正常母胎界面存在Th2免疫偏移現(xiàn)象,這不利于病原體的消除,增加了弓形體病的易感性。因此,弓形蟲孕期感染或隱性感染的激活會增加胎盤中的氧化應激,促進細胞凋亡和胎盤損傷,并最終導致比正常生理狀態(tài)更嚴重的結(jié)果。研究顯示在妊娠相關(guān)疾病中,氧化應激和細胞凋亡之間存在關(guān)聯(lián)。以往的研究表明,LPS可在多個組織中誘導氧化應激,導致小鼠早產(chǎn)。一些研究發(fā)現(xiàn),滋養(yǎng)細胞可被弓形蟲強毒株感染,未感染的細胞會發(fā)生凋亡,而不是受感染的細胞;這個現(xiàn)象揭示弓

6、形蟲誘導的細胞凋亡并不是由于其在母胎界面的直接作用。
　　目的：探討體內(nèi)外剛地弓形蟲感染對滋養(yǎng)細胞凋亡水平的影響;闡明先天性弓形蟲病和弓形蟲誘發(fā)細胞凋亡的具體機制和關(guān)鍵環(huán)節(jié);觀察抗氧化劑對弓形蟲誘發(fā)細胞凋亡的負向調(diào)節(jié)作用,對胎盤病理損傷的保護作用和作為處理相關(guān)疾病的潛在治療價值。
　　方法：(1)本實驗首先使用ICR孕鼠建立孕期弓形蟲急性感染的小鼠模型。孕鼠被隨機分入感染組,抗氧化劑保護組和對照組中。在孕8天和孕9天,抗氧化

7、保護組孕鼠按照100mg/kg的計量被注射NAC。另外,在孕8天,感染組和抗氧化保護組的每只孕鼠經(jīng)腹腔注射200個速殖子。孕鼠處死后,小心剝離并取出胎盤,稱重,按照實驗程序,制作細胞懸液或包氏液固定用于組織化學分析,另外,取部分胎盤液氮凍存。提取感染組孕12天小鼠胎盤RNA,采用包含84個氧化應激關(guān)鍵基因芯片對胎盤組織的表達譜進行分析。制作胎盤組織勻漿,按照檢測試劑盒操作說明,對MDA,GSH和8-OHdG進行檢測。采用實時定量PCR方

8、法,對組織和血液標本的弓形蟲含量,以及氧化應激相關(guān)分子的表達水平進行檢測。(2)分離胎盤滋養(yǎng)細胞,通過抗角蛋白-7和波形蛋白抗體對其性質(zhì)進行鑒定。體外感染使用,采用Transwell系統(tǒng)。在12孔培養(yǎng)板中,速殖子和胎盤細胞按照1×106:1×106比例加入上層;分離的胎盤滋養(yǎng)細胞1×106,加入下層,37℃培養(yǎng),按照預定的時間收集細胞。胎盤組織制作的細胞懸液和原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞分別收集,通過流式細胞和原位末端標記技術(shù)進行細胞凋亡分析。采

9、用熒光定量PCR技術(shù)對胎盤組織氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)標記物進行mRNA水平進行檢測。(3)胎盤組織按照說明勻漿,培養(yǎng)的原代細胞直接加入100μl裂解緩沖液。裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳,蛋白印記分析GRP78,磷酸化JNK,p38,磷酸化p38,caspase-12和磷酸化ASK1進行檢測。為了觀察NAC對胎盤滋養(yǎng)細胞凋亡信號和前凋亡通路激活的影響,抗氧化保護組的胎盤組織和培養(yǎng)原代細胞被相應處理,同時進行熒光定量PCR,流式細胞和蛋白印記

10、分析。
　　結(jié)果：(1)成功建立弓形蟲孕期急性感染小鼠模型。在孕8天腹腔注射200個RH速殖子,感染小鼠在孕14后開始出現(xiàn)感染癥狀,但是多數(shù)在孕16天仍然存活。(2)通過PCR芯片分析,和正常對照組相比,感染組胎盤中有27個氧化應激相關(guān)基因上調(diào)兩倍以上,9個基因下調(diào)兩倍以上。NADPH氧化酶1和谷胱甘肽過氧化酶6上調(diào)最為明顯,約升高25倍?？寡趸M中上述基因差不多回復到正常對照組的水平。通過定量PCR分析,感染組孕10天和孕12天

11、胎盤沒有發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染,但是在14天出現(xiàn)感染的高峰。另外,研究顯示感染組在孕12天前可觀察到蟲血癥的出現(xiàn)和GSH水平的下降。GSH水平從正常組的9.29±2.26μM/gprot下降到感染組的4.18±1.54μM/gprot(p<0.01)。嚴重的氧化應激反應導致脂質(zhì)和DNA的過氧化,表現(xiàn)為MDA和8-OHdG水平增高;分別從對照組的0.41±0.16μM/gprot和1.77±0.65μg/gprot升高到感染組的0.52±0.23

12、μM/gprot和3.88±0.89μg/gprot(p<0.05).NAC使用有效的減弱了過氧化損傷,特別是在早期階段?？寡趸Ｗo組中GSH,MDA和8-OHdG分別為9.42±2.40μM/gprot,0.45±0.21μM/gprot和3.42±1.63μg/gprot(p<0.01,0.05and0.05)。(3)原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞成無規(guī)律的多邊形生長,多數(shù)細胞(90.5±3.5%)為角蛋白-7陽性,通過流式細胞分析,另外大約有

13、5.1%細胞為巨噬細胞。另外,用抗波形蛋白抗體檢測為陰性,表明培養(yǎng)細胞中沒有成纖維細胞存在。弓形蟲感染導致胎盤滋養(yǎng)細胞的凋亡水平明顯增加,總凋亡率,早期凋亡率和晚期凋亡率分別從正常對照組的11.04±0.91%,9.77±0.99%和1.27±0.43%上升到60.71±16.96%,38.57±14.66%和22.14±3.20%。和感染組相比,用NAC預處理可以明顯降低凋亡水平,總凋亡率為40.28±8.96%,(p<0.05),晚

14、期凋亡下降更為明顯,為4.71±2.81%(p<0.05)。上述結(jié)論,被胎盤原位凋亡檢測進一步證實。(4)通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡分析,我們發(fā)現(xiàn)感染組中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記物,如GRP78,CHOP和caspase-12,JNK/ASK1信號上調(diào)或激活;NAC預處理可抑制上述基因的表達或信號通路的激活。本研究中,沒有發(fā)現(xiàn)p38的上調(diào)或活化。
　　結(jié)論：(1)通過在孕8天經(jīng)腹腔注射200個RH速殖子的方法,成功建立了孕期弓形蟲急