弓形蟲表面抗原P30、P22及CTXA-,2--B亞基復(fù)合基因的構(gòu)建及在真核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、本課題根據(jù)Genebank收錄的弓形蟲RH株P(guān)30、P22基因序列和霍亂毒素A<,2>/B的基因序列,自行設(shè)計(jì)合成三對引物,在每條引物的5'末端適當(dāng)?shù)奈恢梅謩e加上合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),以保證開放讀碼框架的正確性為前提,采用分子生物學(xué)定向克隆的方法和基因重組技術(shù),成功構(gòu)建了復(fù)合基因P30-P22-CTXA<,2>/B,并且成功構(gòu)建了含復(fù)合基因的克隆質(zhì)粒(pUC1 8-P30-P22-CTXA<,2>/B)和真核表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3

2、.1-P30-P22-CTXA<,2>/B),并由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞系Hela,經(jīng)過G41 8篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株.同時(shí)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞中,重組質(zhì)粒成功表達(dá)了復(fù)合基因P30-P22-CTXA<,2>/B的融合蛋白,表達(dá)產(chǎn)物行SDS-PAGE蛋白電泳顯示一條分子量大小約為64KDa的蛋白電泳帶,其大小與預(yù)計(jì)的融合蛋白分子量相符,蛋白泳帶轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上,經(jīng)Western Blotting檢測進(jìn)一步證實(shí)該條帶為含P3