大腦突觸體蛋白質(zhì)差異表達和相互作用分析.pdf

1、哺乳動物大腦是信息處理中心以及各種生理活動和行為的控制中心。突觸是大腦神經(jīng)元之間發(fā)生功能聯(lián)系的部位，許多與突觸功能有關的生理生化過程如神經(jīng)遞質(zhì)釋放與激活、神經(jīng)遞質(zhì)受體的調(diào)節(jié)以及信號傳導級聯(lián)放大等都是由突觸中構(gòu)成復雜網(wǎng)絡的突觸蛋白相互協(xié)調(diào)完成的。因此，深入開展突觸蛋白及其相互作用和突觸蛋白在不同生理病理條件下的差異表達研究將有助于進一步了解突觸的結(jié)構(gòu)與功能。本論文研究主要利用蛋白質(zhì)組學及相關技術(shù)研究哺乳動物大腦突觸中與突觸傳遞有關的蛋白質(zhì)

2、相互作用和突觸蛋白在終末糖基化產(chǎn)物累積過程中的差異表達，以發(fā)現(xiàn)和鑒定新的與特定受體和離子通道相互作用的蛋白，從而加深對突觸傳遞分子機制的了解。
　　 已有證據(jù)表明，給C57 BL/6小鼠注射高劑量的半乳糖會導致終末糖基化產(chǎn)物(AGEs)的累積，從而引發(fā)糖尿病以及糖尿病并發(fā)癥。如，糖尿病神經(jīng)病變是糖尿病并發(fā)癥中的一種，該疾病能使病人的學習能力和記憶能力減弱。學習和記憶能力減弱的根源在于突觸蛋白以及蛋白質(zhì)復合物的表達發(fā)生了改變。為了

3、探討AGEs誘導的突觸蛋白的差異表達，我們給C57 BL/6小鼠注射高劑量的半乳糖后采用blue native/SDS-PAGE結(jié)合iTRAQ標記技術(shù)分析了小鼠大腦皮質(zhì)中差異表達的突觸蛋白。發(fā)現(xiàn)84個蛋白質(zhì)的表達水平在AGEs累積過程中發(fā)生了變化。這些差異表達的蛋白質(zhì)主要涉及神經(jīng)遞質(zhì)釋放、能量代謝以及信號傳導等過程，說明在AGEs累積過程中，能量代謝和神經(jīng)信號傳遞過程被削弱。闡明AGEs累積導致的差異表達蛋白有助于我們了解糖尿病神經(jīng)病變

4、中學習和記憶能力減弱的分子機制并為治療這些疾病提供參考。
　　 突觸結(jié)合蛋白Ⅰ是突觸囊泡膜上一種與Ca2+調(diào)控的胞吐作用有關的重要蛋白質(zhì)，能感受鈣內(nèi)流并引發(fā)囊泡的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。盡管有很多關于這個蛋白質(zhì)的研究，但目前對于突觸結(jié)合蛋白Ⅰ在突觸傳遞過程中的具體功能和作用機制仍不很清楚。突觸結(jié)合蛋白Ⅰ分子中特異蛋白質(zhì)互作結(jié)構(gòu)域的存在使人們推測它們可能與多種涉及突觸傳遞的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究在鑒定能與突觸結(jié)合蛋白Ⅰ

5、結(jié)合的可能的新蛋白時，通過blue native PAGE發(fā)現(xiàn)了一個新的能與突觸結(jié)合蛋白I相互作用的低分子量GTP結(jié)合蛋白一Rab3A，然后利用大鼠突觸質(zhì)膜蛋白提取物用免疫共沉淀實驗證實了Rab3A能以不依賴于Ca2+的方式與突觸結(jié)合蛋白Ⅰ產(chǎn)生很強的相互作用。通過定點突變和GST pull down實驗對突觸結(jié)合蛋白Ⅰ中Rab3A的結(jié)合位點進行了分析，發(fā)現(xiàn)突觸結(jié)合蛋白工分子中C2B結(jié)構(gòu)域的KKKK模體為Rab3A結(jié)合所必需；肌酸6磷酸能

6、調(diào)節(jié)Rab3A與突觸結(jié)合蛋白Ⅰ的結(jié)合。鑒于Rab3A能抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放且與tSNAREs復合物(突觸融合蛋白/SNAP-25)中的突觸融合蛋白在突觸結(jié)合蛋白Ⅰ中的結(jié)合位點相同，推測Rab3A可能與突觸融合蛋白競爭性結(jié)合突觸結(jié)合蛋白Ⅰ分子中的相同位點，通過影響突觸結(jié)合蛋白Ⅰ與突觸融合蛋白/SNAP-25復合物的相互作用而達到抑制膜融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的目的。我們設計了一個體外實驗驗證這一推測。本部分研究證實，Rab3A是突觸結(jié)合蛋白Ⅰ的一

7、種新的相互作用蛋白，它們間的直接相互作用在突觸傳遞的膜融合調(diào)節(jié)中起著十分重要的作用。研究結(jié)果加深了我們對突觸傳遞調(diào)控機制的了解。
　　 電壓門控鉀離子通道Kv1.4是突觸前膜中一種重要的A型鉀離子通道，此通道能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的興奮性。Kv1.4在膜上的表達、定位、通道動力學以及翻譯后修飾等都受其相互作用蛋白的調(diào)控。盡管已有一些關于Kv1.4相互作用蛋白研究的報道，但仍有很多問題有待解決。本研究通過免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)

8、發(fā)現(xiàn)突觸結(jié)合蛋白Ⅰ能與突觸前膜的Kv1.4蛋白形成天然復合物，表明突觸結(jié)合蛋白Ⅰ是Kv1.4的相互作用蛋白。用突觸結(jié)合蛋白Ⅰ特異的抗體能使Kv1.4蛋白共沉淀進一步證明了這一結(jié)論。免疫組化實驗表明，突觸結(jié)合蛋白Ⅰ和Kv1.4蛋白在海馬的CA3區(qū)具有共定位。此外，我們利用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)突觸結(jié)合蛋白Ⅰ能延緩HEK293T細胞中Kv1.4的失活，但不影響其激活動力學；突觸結(jié)合蛋白Ⅰ與Kv1.4的結(jié)合依賴于Ca2+的存在。實驗證明突觸結(jié)合蛋白Ⅰ