云南野生稻遺傳特性及其優(yōu)良基因克隆的研究.pdf

1、云南野生稻是珍貴的野生植物資源，蘊藏著十分豐富的優(yōu)良種質基因，是改良栽培稻，可供人類長期持續(xù)發(fā)掘利用的重要基因寶庫。野生稻過去在云南分布廣，生態(tài)類型多，但是，隨著人類活動其適生環(huán)境遭到破壞，而處于瀕危狀態(tài)。因此，開展對云南野生稻現(xiàn)存資源的調查和保存保護研究，及主要遺傳特性和有關基因(片段)的分離研究，有助于促進對野生稻資源的保存、研究和利用，具有重要的理論和實際意義。 1 云南野生稻資源最新分布狀況調查和營養(yǎng)成分研究

2、對云南野生稻現(xiàn)存分布情況進行了較為系統(tǒng)的調查，新發(fā)現(xiàn)了1個普通野生稻自然分布居群，2個藥用野生稻自然分布居群和5個疣粒野生稻自然分布居群。通過RAPD和ISSR分子標記分析，發(fā)現(xiàn)居群間的遺傳距離大于居群內不同點或植株間的遺傳距離。揭示了云南普通野生稻不同類型材料與具A’A’基因組的國內其它地區(qū)普通野生稻代表材料的遺傳距離。 首次對云南野生稻稻米總蛋白質含量、17種氨基酸含量和10種無機元素(其中Ca、Fe、Zn為人體健康有益元素

3、)的比較分析發(fā)現(xiàn)，野生稻稻米的蛋白質含量最高達19.3％，一般為13％～16％，比栽培秈稻和粳稻的稻米蛋白質含量高出50％～80％。在人體必需氨基酸和有益無機元素中，野生稻多數(shù)種類和類型的含量都顯著高于秈稻和粳稻。發(fā)現(xiàn)野生稻稻米的高含量蛋白質、人體必需氨基酸以及Zn和Fe，都受遺傳控制為主，可能遺傳力高，但是Ca、Mn等元素可能遺傳力小。 上述結果表明，雖然云南野生稻自然資源消亡很多，但是現(xiàn)存資源的遺傳 2云南野生稻基因

4、文庫的構建 構建了普通野生稻、藥用野生稻和疣粒野生稻的細菌人工染色體(BMC)文庫，克隆數(shù)分別為25,000個、28，000個和30，000個；文庫的染色體覆蓋率達到3.0—5.0，插入片段的平均長度為80kb。構建了元江普通野生稻6葉期葉片的全長cDNA文庫，文庫克隆數(shù)為2.97×10<'6>，重組率為91％。構建了疣粒野生稻葉片經過白葉枯病原菌誘導處理和未處理的全長cDNA文庫各1個，前者的克隆數(shù)為1.05×10<'7>，重

5、組率為97％；后者的克隆數(shù)為1×10<'7>，重組率為96％。此外，還構建了疣粒野生稻的抑制消減雜交文庫(SSH文庫)，獲得1，002個克隆，重組率高達99.4％。 根據(jù)cDNA測序定結果，首次從元江普通野生稻中發(fā)現(xiàn)了15個與能量代謝包括光合電子傳遞、ATP合成、光呼吸、氧化還原反應有關的蛋白質基因。從白葉枯病菌處理后的疣粒野生稻中，發(fā)現(xiàn)83個cDNA序列與已知功能基因的同源性較高，共有17種功能，另有21個cDNA無對應的

6、已知功能基因，它們可能是新基因。從疣粒野生稻SSH文庫的部分cDNA測序分析后發(fā)現(xiàn)23個功能已知的cDNA，它們不同程度地參與抗病相關多種代謝，發(fā)現(xiàn)了8個新基因。3云南野生稻直鏈淀粉合成酶及其基因克隆的研究 首次對云南野生稻稻米總淀粉和直鏈淀粉含量進行了測定，結果顯示，3種云南野生稻米總淀粉含量與普通栽培稻相近，而直鏈淀粉含量(10％～13％)均顯著低于栽培秈稻和粳稻。酶活測定發(fā)現(xiàn)，3種野生稻中的ADPG酶、SSS酶、Q酶活

7、性高，其主要作用是增加野生稻灌漿速率，而對直鏈淀粉含量的作用不大。3種野生稻的GBSS酶活性明顯低于栽培稻，但該酶活性大小則與3種野生稻直鏈淀粉含量變化趨勢完全吻合，說明GBSS在決定野生稻米直鏈淀粉含量中起到重要作用。 利用栽培稻的waxy基因保守序列設計引物，對3種云南野生稻的基因組進行PCR擴增，獲得了元江普通野生稻和藥用野生稻的waxy基因全長序列(第1內含子除外)和疣粒野生稻Waxy基因部分序列。對Waxy基因

8、序列的分析結果表明，元江普通野生稻和藥用野生稻Waxy基因有13個外顯子，而疣粒野生稻waxy基因僅克隆到前10個外顯子。對推測的waxy基因EST序列同源分析發(fā)現(xiàn)，3種野生稻與栽培稻之間的DNA序列同源性低于不同栽培稻品種之間的同源性，推測的氨基酸序列與核苷酸變化趨勢基本相同。3種野生稻Waxy基因的堿基差異主要出現(xiàn)在內含子中，其中有堿基插入、缺失或堿基轉換和顛換；在藥用野生稻和疣粒野生稻Waxy基因中發(fā)生堿基轉換和顛換的比例非常高。

9、4云南野生稻抗稻瘟病的鑒定及其抗性基因的克隆 在自然生長環(huán)境下系統(tǒng)鑒定多種野生稻對稻瘟病抗性的結果顯示，藥用野生稻從中抗到強抗；多數(shù)疣粒野生稻為中抗；元江普通野生稻和部分類型的景洪普通野生稻則抗性差，個別甚至為易感型；但是景洪普通野生稻的直立類型對強致病性稻瘟病菌高抗。在3種野生稻中篩選出1批高抗病害材料。 根據(jù)水稻品種愛知旭的抗稻瘟病基因Pi-ta DNA序列，設計并合成引物，通過PCR方法從元江普通野生稻和景洪直立型普通野

10、生稻中克隆到Pi-ta基因編碼序列。元江普通野生稻與愛知旭的Pi-ta基因有9個堿基的差異，導致7個氨基酸殘基的變異，其中2個發(fā)生在NBS(nuclear bindin site)區(qū)域內，特別是發(fā)生在第906位上的氨基酸殘基的變異(由苯丙氨酸變?yōu)榻z氨酸)，導致蛋白質空間結構較大改變，可能是導致元江普通野生稻成為無抗稻瘟病病能力的主要原因。雖然景洪直立型普通野生稻的全長Pi-ta基因與愛知旭的Pi-ta基因也有9個堿基的差異，造成6個氨基

11、酸殘基的變異，在NBS區(qū)域內只有1個氨基酸發(fā)生變異，但并未發(fā)生在第906位氨基酸上，因此沒有造成蛋白質空間結構較大改變，這可能是景洪直立型普通野生稻仍具有抗稻瘟病能力的原因。本研究還通過分離其它幾種野生稻和栽培稻中Pi-ta基因關鍵結構域LRD片段，發(fā)現(xiàn)它們和栽培稻中的Pi-ta基因都為非抗性基因。根據(jù)這些材料中Pi-ta基因同源序列的差異，分析了該抗病基因的遺傳關系和進化關系。 采用3種調查方式對云南野生稻現(xiàn)存分布情況進行了系

12、統(tǒng)徹底的調查，新發(fā)現(xiàn)了1個普通野生稻自然分布居群，2個藥用野生稻自然分布居群和5個疣粒野生稻自然分布居群，大大豐富了云南野生稻的遺傳資源。分析了現(xiàn)存于云南的普通野生稻的遺傳多樣性，通過RAPD和工SSR分子標記分析后發(fā)現(xiàn)，居群間的遺傳距離大于居群內不同點或植株間的遺傳距離。揭示了云南普通野生稻不同類型材料與具A’A’基因組的國內其它地區(qū)普通野生稻代表材料的遺傳距離，與國外非洲長雄野生稻的遺傳距離，以及與栽培稻的遺傳距離。從而在形態(tài)學和分

13、子水平上進一步證明了云南普通野生稻幾大類型所擁有的遺傳多樣性仍較豐富，是國內其它地區(qū)無法比擬的。 從普通野生稻的形態(tài)、DNA分子遺傳多樣性分析，以及從3種野生稻米主要營養(yǎng)成分反映的多樣性表明，雖然云南野生稻自然資源已經消亡很多，但是現(xiàn)存資源的遺傳多樣性仍然較豐富，值得對資源進行深入研究、發(fā)掘利用。 為了保護云南野生稻遺傳資源，我們構建了云南野生稻的細菌人工染色體(BAC)文庫，eDNA文庫和抑制消減雜交(SSH)文庫。構

14、建的普通野生稻、藥用野生稻和疣粒野生稻BAC文庫克隆數(shù)分別為25,000個、28，000個和30，000個；文庫的染色體覆蓋率達到3.0一5.0，插入片段的平均長度為80kb(分布在20kb-150kb范圍內)。經100次繼代培養(yǎng)，進行部分克隆檢測，所插入片段仍保持完整，表明BAC文庫是穩(wěn)定的，能夠永久保存3種野生稻代表材料的遺傳物質。構建了元江普通野生稻6-7葉期葉片的全長cDNA文庫，插入片段在400bp-2000bp之間，文庫克隆

15、數(shù)為2.97×10<'6>，重組率為91％。構建了疣粒野生稻葉片經過白葉枯病原菌誘導處理和未處理的全長eDNA文庫各1個，誘導處理葉片cDNA文庫的克隆數(shù)為1.05×10<'7>，重組率為97％；未誘導處理葉片eDNA文庫的克隆數(shù)為1×10<'7>，重組率為96％， cDNA片段長度在0.5kb-2.0kb之間。此外，還構建了疣粒野生稻的抑制消減雜交文庫(SSI-文庫)，獲得1，002個克隆，重組率高達99.4％。 為了進一步

16、確定上述文庫的質量，從元江普通野生稻cDNA文庫中隨機挑取了部分克隆進行cDNA序列測定，首次從元江普通野生稻中發(fā)現(xiàn)了15個與能量代謝包括光合電子傳遞、ATP合成、光呼吸、氧化還原反應有關的蛋白質基因。測定了疣粒野生稻白葉枯病菌處理葉片cDNA文庫的192個克隆的序列，獲得121條非冗余的cDNA片段，其中有83條cDNA與已知功能基因的同源性較高，共有17種功能；另有21個cDNA無對應的已知功能基因，可能是新基因。從疣粒野生稻SSH