中國龍蝦基因組文庫的構(gòu)建及微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選.pdf

1、本文通過構(gòu)建中國龍蝦(Panulirus stimpsoni)的小片段基因組文庫并運用PCR法從中篩選含有中國龍蝦微衛(wèi)星序列的重組陽性克隆。篩選的引物為pUC118載體兩端的通用引物M13+/-以及自行設(shè)計的核苷酸重復(fù)序列引物(CT)15和(AT)15，通過M13+/-與核苷酸重復(fù)序列引物(CT)15和(AT)15進(jìn)行組合配對，對中國龍蝦基因組文庫中的重組陽性克隆進(jìn)行篩選。對經(jīng)過篩選后可能含有中國龍蝦微衛(wèi)星序列的重組陽性克隆進(jìn)行測序，首

2、次得到了78個中國龍蝦微衛(wèi)星序列，分別分布于55個中國龍蝦重組陽性克隆中。對78個中國龍蝦微衛(wèi)星序列進(jìn)行分類，其中perfect 50個，占64％；imperfect 3個，占3.8％；compound perfect 6個，占7.7％；compound imperfect 19個，占24.5％。這些微衛(wèi)星序列都已經(jīng)在Genbank中進(jìn)行了注冊。研究結(jié)果還表明，在中國龍蝦基因組DNA中，(CT)n、(AT)n形式的微衛(wèi)星序列的含量非常豐

3、富。從78個中國龍蝦微衛(wèi)星序列中選取了24個較好的微衛(wèi)星序列，運用Primer5.0進(jìn)行引物設(shè)計并委托上海生物工程有限公司合成24對微衛(wèi)星引物。經(jīng)過設(shè)置梯度退火溫度進(jìn)行PCR篩選，2％瓊脂糖電泳和8％聚丙烯酰胺電泳檢測PCR產(chǎn)物，24對微衛(wèi)星引物中有20對能夠擴增出產(chǎn)物，再經(jīng)過調(diào)節(jié)、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，應(yīng)用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最終篩選出具有多態(tài)性的中國龍蝦微衛(wèi)星引物17對，其中合適進(jìn)行中國龍蝦微衛(wèi)星分析的引物有15對。在20個中

4、國龍蝦樣本中用具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物擴增其基因組DNA，在15個微衛(wèi)星位點上，得到等位基因的數(shù)目為3到12個不等，等位基因的大小分布在78bp到425bp之間，基本符合引物設(shè)計的理論長度。這些微衛(wèi)星位點的期望雜合度范圍為0.48到0.87，平均值為0.71，表明中國龍蝦基因組微衛(wèi)星具有較高的雜合度，中國龍蝦具有較高的遺傳多樣性。其中15個微衛(wèi)星位點的：PIC值從0.44到0.84，平均值為0.60，說明這些微衛(wèi)星位點在中國龍蝦基因組中包