乙肝肝硬化患者腸道微生物宏基因組學(xué)的研究.pdf

1、人體作為一個超個體,其生理健康不僅會受到外界環(huán)境與自身基因的影響,也會受到機體自身寄居微生物的影響。人體內(nèi)的微生物組可以看做是一個虛擬的器官,執(zhí)行著機體的多種代謝功能。而人體大部分的細(xì)菌是寄居在腸道的,腸道微生物基因組被譽為人類的“第二基因組”。
　　正常成年人結(jié)腸內(nèi)pH在5.5～7.0之間,并且腸道菌群結(jié)構(gòu)趨于近似,擬桿菌屬占腸道菌群30％,而腸桿菌屬和腸球菌屬的含量少于1%。腸道中的專性厭氧菌本身對于維持腸道菌群結(jié)構(gòu)的平衡起著

2、至關(guān)重要的作用,專性厭氧菌作為腸道中的菌膜屏障,主要通過兩種途徑來阻止腸道潛在致病菌(通常為兼性厭氧或需氧菌)及毒素在腸上皮細(xì)胞的粘附,其一,通過與腸上皮細(xì)胞緊密結(jié)合,占據(jù)空間;其二,通過競爭營養(yǎng)物質(zhì),產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物,降低腸道pH。
　　據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示,全球每年約有60萬人死于慢性HBV感染。截止至2010年,中國有1.2億人感染HBV。HBV侵襲肝臟后在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,從根本上損害肝臟功能,其誘導(dǎo)的機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答會

3、產(chǎn)生兩種效果:殺死肝細(xì)胞和清除HBV病毒,經(jīng)過數(shù)年的遷延,發(fā)展為肝硬化。在我國,肝硬化患者中血清HBVDNA陽性率高達(dá)76.7%。
　　肝硬化主要從以下三個方面影響腸道微環(huán)境:(1)門脈高壓,導(dǎo)致靜脈回流受阻,胃腸道淤血,組織水腫,胃腸蠕動減慢,進一步引起腸道通透性增加,pH值改變;(2)肝功能受損,導(dǎo)致膽汁酸分泌減少、對內(nèi)毒素的清除能力下降等,影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝;(3)宿主抵抗力降低。以上三個因素共同作用,導(dǎo)致腸道微環(huán)境改

4、變,腸道菌群失調(diào)。而在此影響下,乙肝肝硬化患者腸道中具體發(fā)生了怎樣的改變,目前還沒有一個完整準(zhǔn)確的認(rèn)識。
　　宏基因組學(xué)的研究方法具有明顯的優(yōu)勢,是解決這一問題的一個很好的方法。宏基因組學(xué)是指直接提取環(huán)境樣品中的宏基因組進行高通量測序和生物信息學(xué)分析。傳統(tǒng)微生物學(xué)以及微生物基因組學(xué)都是以可培養(yǎng)的微生物克隆產(chǎn)物為基礎(chǔ)的,而目前自然界中有大于99%的細(xì)菌在實驗室無法檢出,培養(yǎng)的局限性使人們錯過了捕捉眾多微生物多樣性的機會。由于宏基因組

5、學(xué)可以揭示先前隱藏在微環(huán)境中的物種多樣性,是理解整個生命世界的一次改革,使人們在觀察微生物世界時擁有更為寬廣的視野。宏基因組學(xué)研究的測序數(shù)據(jù)龐大而且復(fù)雜,包含代表著10,000個物種的DNA片段。從如此龐大復(fù)雜的數(shù)據(jù)中收集、提取有用的生物學(xué)信息無疑向研究者提出了很大的挑戰(zhàn)。
　　因此,本課題首次利用宏基因組學(xué)的方法分析了乙肝肝硬化患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)變化及功能代謝變化。選取16例乙肝肝硬化患者作為病例組,20例健康人作為對照組,分別

6、來自于中國人民解放軍302醫(yī)院消化科的病人和病人的家屬。研究對象均為40～60歲,身體質(zhì)量指數(shù)在18.5～24.9kgm–2之間,無明顯的飲食偏好。病例組要求患者血清HBVDNA陽性,肝組織學(xué)上存在彌漫性纖維化及假小葉形成,臨床診斷為乙肝后肝硬化,無并發(fā)癥,無結(jié)腸炎等胃腸道疾病,無其它感染性疾病。要求乙肝肝硬化患者和正常人在留取腸道糞便樣品的前一周未服用抗生素、類固醇等激素、中草藥制劑(包括口服,肌肉注射或靜脈注射),未服用微生態(tài)制劑或

7、酸奶等益生菌。提取病例組和對照組的腸道微生物宏基因組DNA,進行高通量Solexa測序,并對測序結(jié)果進行生物信息學(xué)分析,包括稀釋分析,主成分分析,顯著差異基因的物種注釋,eggNOG功能注釋,KEGG代謝通路的注釋及分析等。
　　研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常人相比,乙肝肝硬化患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為擬桿菌屬顯著減少(P<0.05),韋榮氏球菌屬和腸桿菌科顯著增加(P<0.05),另外,乙肝肝硬化患者腸道微生物的功能代謝發(fā)生改變

8、,與氨基酸的轉(zhuǎn)運和代謝、無機離子的轉(zhuǎn)運和代謝、次級代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運和代謝、能量及異生物質(zhì)的代謝等功能相關(guān)的基因相對豐度顯著增加(P<0.01),而與細(xì)胞壁/膜的生物起源、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、復(fù)制、重組和修復(fù)等功能相關(guān)的基因相對豐度顯著減少(P<0.05),膽汁酸代謝分析發(fā)現(xiàn),肝硬化患者腸道微生物中次級膽汁酸代謝通路相關(guān)的基因相對豐度顯著減少(P=0.013)。
　　初級膽汁酸在肝臟中合成,隨膽汁進入腸道,在膽酸鹽水解酶的解離和脫羥基作用下

9、分解為次級膽汁酸。擬桿菌屬產(chǎn)生膽酸鹽水解酶,而膽酸鹽水解酶介導(dǎo)的解離和脫羥基作用為擬桿菌屬提供碳源、氮源和能量來源,二者相互依存,一方減少,另一方也隨之削弱。
　　腸道中的膽鹽達(dá)到一定濃度后會聚合成極性微膠粒,腸道中的脂肪酸、甘油一酯等代謝產(chǎn)物與微膠粒結(jié)合被運載到腸粘膜表面而被吸收。韋榮氏球菌屬會水解聚合的膽鹽,阻礙微膠粒形成。乙肝肝硬化患者腸道中韋榮氏球菌屬顯著增加,因此微膠粒合成受阻,膽汁滯留,膽道部分阻塞,從而加重肝硬化。<

10、br>　　有研究表明,韋榮氏球菌屬和腸桿菌科通常在人體空腸分離物中檢測到,而它們在肝硬化患者結(jié)腸中的顯著增加,可能是細(xì)菌易位的結(jié)果。韋榮氏球菌屬和腸桿菌科均為革蘭氏陰性細(xì)菌,可以產(chǎn)生內(nèi)毒素。在正常人當(dāng)中,由于肝臟Kupffer細(xì)胞的清除功能,內(nèi)毒素在血液中的含量極其微弱,小于0.1EU/ml,不會形成內(nèi)毒素血癥影響到正常人的身體健康。而肝硬化患者肝臟清除功能降低,門-體側(cè)枝循環(huán)形成,門脈高壓導(dǎo)致腸壁水腫和通透性增加,在這些因素的共同作用

11、下,內(nèi)毒素入血增加。一方面,內(nèi)毒素會誘導(dǎo)一些細(xì)胞因子(如TNF,IL-1和IL-6)的分泌,這些細(xì)胞因子會引起細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解異常,從而促進肝纖維化的進程。另一方面,腸道中韋榮氏球菌屬和腸桿菌科過度繁殖,產(chǎn)生的過量內(nèi)毒素會抑制腸上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成,因此腸壁屏障受損,進一步威脅到腸道微環(huán)境,導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。另外,內(nèi)毒素抑制腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成,從而改變腸壁上的載體錨定點,導(dǎo)致氨基酸和碳水化合物等物質(zhì)在運輸過程中出現(xiàn)異?；蛉毕?。

12、
　　乙肝肝硬化患者腸道微生物富集物質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝功能相關(guān)的基因,而缺失細(xì)菌周期相關(guān)的基因。由此推測,由于門脈高壓,肝功能障礙,宿主抵抗力降低等因素共同作用,腸道微環(huán)境發(fā)生改變,對腸道菌群的生長造成了一個逆環(huán)境,在這種壓力條件下,促進了一些腸道菌群對物質(zhì)轉(zhuǎn)運和代謝的作用加強,形成更為廣泛的代謝途徑。
　　本課題首次從一個綜合的角度和寬廣的視野向人們展現(xiàn)了肝硬化患者腸道微環(huán)境的變化,并發(fā)現(xiàn)肝硬化與腸道菌群失調(diào)之間存在多個惡性循環(huán)