基于宏基因組技術(shù)發(fā)掘動(dòng)物消化道微生物新型木聚糖酶基因.pdf

1、木聚糖是植物細(xì)胞壁的重要組成成分，結(jié)構(gòu)錯(cuò)綜復(fù)雜，自然環(huán)境下很難被降解。木聚糖酶能夠有效地作用于木聚糖主鏈的β-1，4糖苷鍵，是水解木聚糖的關(guān)鍵酶。微生物源木聚糖酶在自然界分布最為廣泛，通過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)分離到的活性高和穩(wěn)定性好的優(yōu)良菌株已被應(yīng)用于食品、飼料、能源、紡織和造紙等工業(yè)中。但越來(lái)越多的試驗(yàn)證明，環(huán)境微生物絕大多數(shù)是不可培養(yǎng)的，如何發(fā)掘不可培養(yǎng)微生物的木聚糖酶基因資源，找到更具應(yīng)用價(jià)值的新型木聚糖酶，一直是酶工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

2、r>　　為此本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的湖羊Fosmid文庫(kù)為對(duì)象，對(duì)篩選獲得的18個(gè)木聚糖酶陽(yáng)性克隆進(jìn)行基因功能分析，并利用木聚糖酶（糖苷水解酶家族10和11）功能域通用引物，從麋鹿、澳洲馬、湖羊、奶牛、熊貓和兔子消化道微生物基因組DNA中擴(kuò)增木聚糖酶功能域基因片段，在研究木聚糖酶基因多樣性的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增木聚糖酶基因開放閱讀框，以期獲得具有應(yīng)用潛力的新型木聚糖酶基因。
　　1、Fosmid文庫(kù)中陽(yáng)性克隆子的測(cè)序分析
　　經(jīng)過(guò)O

3、RF翻譯和蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)，18個(gè)木聚糖酶陽(yáng)性克隆測(cè)序共獲得6個(gè)編碼木聚糖酶的基因。ORF1和ORF2（命名為xyn-lxy）與不可培養(yǎng)細(xì)菌uncultured bacterium Contig1552來(lái)源的木聚糖酶基因相似性分別達(dá)到94.1％和97％; ORF3、ORF4和ORF5與Fibrobacter succinogenes subsp.S85來(lái)源的木聚糖酶基因相似性分別為39％、47％和76％; ORF6與不可培養(yǎng)的細(xì)菌uncu

4、lturedbacterium LAB20來(lái)源的木聚糖酶基因相似性達(dá)到91.6％。xyn-lxy基因長(zhǎng)度為1923 bp，含有起始密碼子(ATG)和終止密碼子（TAA），編碼641個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子量分別為4.95和71.27 kDa，屬于糖基水解酶GH10家族。
　　2、xyn-lxy基因的克隆與表達(dá)
　　克隆木聚糖酶基因xyn-lxy，將其在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。超聲波破碎純化后測(cè)得重組酶Xyn-LXY的蛋白

5、質(zhì)分子量為97kDa。酶學(xué)特性分析結(jié)果顯示，Xyn-LXY最適反應(yīng)溫度為45℃，最適pH為6.0，最高酶活力為1360 U/mg，金屬離子Mn2+對(duì)其具有促進(jìn)作用。以山毛櫸木聚糖為底物時(shí)，液相色譜分析結(jié)果顯示， Xyn-LXY的水解產(chǎn)物主要是木二糖和木糖，每U Xyn-LXY木聚糖酶可生成0.251 mg木二糖和0.076 mg木糖。
　　3、木聚糖酶基因的多樣性分析
　　采用GH10和GH11家族功能域通用引物分別從麋鹿、

6、澳洲馬和熊貓的糞便、奶牛和湖羊瘤胃內(nèi)容物、兔子盲腸內(nèi)容物的基因組DNA中擴(kuò)增木聚糖酶基因片段，構(gòu)建GH10和GH11家族功能域文庫(kù)，從每個(gè)文庫(kù)中隨機(jī)挑取96個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序，麋鹿、澳洲馬、奶牛、湖羊、熊貓和兔子的GH10家族文庫(kù)中分別有71，27，80，93，25和52個(gè)序列確認(rèn)來(lái)自GH10家族;GH11家族文庫(kù)中，麋鹿、奶牛、湖羊、熊貓和兔子分別有32、26、12、65，52條序列確認(rèn)來(lái)自GH11家族，在澳洲馬的GH11家族文庫(kù)中

7、，沒(méi)有擴(kuò)增到該家族的基因片段。
　　經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)顯示，GH10家族木聚糖酶基因主要是不可培養(yǎng)微生物來(lái)源（Uncultured organisms），其次是變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes);GH11家族木聚糖酶基因主要來(lái)自厚壁菌門、放線菌門和真菌(Fungi)。GH10家族文庫(kù)中，麋鹿有69％的序列來(lái)自變形菌門，30％的序列來(lái)自放線菌門，其中

8、假黃色單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬;澳洲馬有50％的序列被歸類到放線菌門，25％的序列歸類到變形菌門，15％的序列未被分類;奶牛和湖羊很相似，20％的序列來(lái)自擬桿菌門，80％的序列未被分類;熊貓有88％的序列來(lái)自變形菌門，未被分類的序列和歸類到厚壁菌門的序列各占6％，兔子有75％和25％的序列被歸類到擬桿菌門和厚壁菌門組成。GH11家族文庫(kù)中被歸類的序列很少，麋鹿有3條序列劃分到放線菌門，1條序列被歸類到真菌;奶牛有5條序列被歸類到放線菌和厚壁菌

9、，還有10條序列劃分到真菌，湖羊有2條序列劃分到放線菌門，5條序列歸類到厚壁菌門，熊貓有12條序列劃分到真菌，兔子被劃分的27條序列全部來(lái)自厚壁菌門。
　　門水平劃分并非包含基因文庫(kù)的所有序列，對(duì)各物種GH10和GH11家族的OTU代表序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，大量序列單獨(dú)成簇，說(shuō)明動(dòng)物消化道木聚糖酶基因具有新穎性，有較高的發(fā)掘價(jià)值。
　　4、xyn-fl全長(zhǎng)序列擴(kuò)增初步探索
　　從所有文庫(kù)中選擇OTU數(shù)量多，且與數(shù)據(jù)