堿性造紙廢液微生物木聚糖酶的基因克隆、表達(dá)及相關(guān)性質(zhì)研究.pdf

1、植物細(xì)胞壁半纖維素中最具代表性的組分為木聚糖,其可被木聚糖酶水解為低聚木糖和木糖。木聚糖酶在飼料、紙漿造紙、食品、能源及環(huán)境科學(xué)等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。而堿性木聚糖酶特有的高pH耐受性,使其在基因工程和工業(yè)應(yīng)用,特別是造紙生產(chǎn)中,有著重要的理論和實(shí)用價(jià)值。
　　 堿性環(huán)境中蘊(yùn)含大量新穎的未培養(yǎng)微生物及可培養(yǎng)未開發(fā)的微生物,為新型酶制劑的開發(fā)提供了寶貴的材料。本論文以采自造紙廠的堿性工業(yè)廢水及活性污泥為實(shí)驗(yàn)材料,采用兩種途徑獲取

2、木聚糖酶資源。一是從環(huán)境基因組中直接進(jìn)行木聚糖酶基因的克隆表達(dá),以開發(fā)未培養(yǎng)微生物中木聚糖酶基因資源。另一方面采用富集培養(yǎng)的方法從此環(huán)境中分離微生物,并對可培養(yǎng)微生物中木聚糖酶基因進(jìn)行研究。
　　 根據(jù)木聚糖酶催化保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物,利用Touchdown-PCR等技術(shù),直接以堿性的造紙廢液環(huán)境基因組DNA為模板,克隆得到22個(gè)木聚糖酶基因片段,進(jìn)一步通過Tail-PCR方法獲得8個(gè)完整的小聚糖酶基因,它們的命名及與已知核苷酸序

3、列的一致性為aws-2x(64％)、aws-3x(52％)、aws-4x(43％)、aws-5x(63％)、aws-6x(48％)、xyn-9(71％)、xyn-11(69％)、xyn-b39(86％),它們中大多數(shù)與已知基因序列一致性較低,具有較好的新穎性。
　　 對其中4個(gè)基因aws-2x,aws-4x、aws-5x、xyn-b39進(jìn)行大腸桿菌異源表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究,重組蛋白AWS-2X、AWS-4X、AWS-5X、XYN-

4、B39在堿性條件下均表現(xiàn)出較好的耐受性,而在極酸性條件下卻沒有活性。在pH9.0下,AWS-2X可以保持最大活性的50％以上,AWS-4X可以保持30％以上,AWS-5X可以達(dá)到70％以上,XYN—B39可以保持80％以上的活性,甚至在pH10.0還可以保持40％的活性,而它們在pH5.0以下均沒有活性。此外,每一個(gè)酶具有較為獨(dú)特的性質(zhì)。AWS-2X對于硬木木聚糖的特異性遠(yuǎn)高于其它來源木聚糖,對于櫸木木聚糖的活性是燕麥木聚糖活性的2.3

5、倍；AWS-4X是一個(gè)單結(jié)構(gòu)域的雙功能木聚糖酶,葡聚糖酶活性可以達(dá)到木聚糖酶活性的12.9％；AWS-5X具有很好的金屬離子抗性,10 mM Mg2+和Fe2+對分別對其有1.21和1.12倍的激活作用;XYN-B39是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域的第十家族木聚糖酶,包括兩個(gè)CBM4—9、一個(gè)GH10的CD,一個(gè)CBM9及三個(gè)SLH結(jié)構(gòu)域,通過紙漿漂白實(shí)驗(yàn)分析,XYN-B39可以提高紙漿白度,明顯降低紙漿膏伯值。
　　 除了直接從環(huán)境中克隆基因

6、外,本研究還從堿性造紙廢液中分離得到一株具有較強(qiáng)木聚糖降解能力的菌株,經(jīng)16S rDNA鑒定命名為Paenibacillus sp.12—11。從中克隆得到同一基因簇上的木聚糖酶xyn-7c和xyn-7x。重組酶XYN-7C的最適pH為8.0,其酶蛋白的氨基酸組成、電荷比等特征顯示它可以作為一個(gè)很好的堿性木聚糖酶的研究材料。
　　 本研究選擇堿性廢液為研究材料,所得到的木聚糖酶均能在堿性條件下具有較好活性及穩(wěn)定性,而且一般在極酸