純培養(yǎng)微生物全基因組深度測序研究.pdf

1、微生物是包括細菌、病毒、真菌以及一些小型原生動物等在內(nèi)的一大類生物群體,它個體微小,卻與人類生活密切相關。隨著現(xiàn)代分子生物學的快速發(fā)展及生物醫(yī)學水平的提高,人們逐漸了解到是遺傳信息決定了生物體的生命特征,包括外部形態(tài)、生命活動等,而基因組是這些遺傳信息的攜帶者。因此全基因組序列的研究將大大有助于揭示生命的本質(zhì)和探索生命的起源。微生物全基因組測序?qū)τ谡J識微生物的生物學特征,研究病原體微生物的遺傳變異、毒力基因和致病性等具有重要意義。

2、>　　本研究基于Ion Torrent高通量測序技術,探索了獲得純培養(yǎng)微生物全基因組序列的方法。革蘭氏染色法把細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌兩大類,這兩類菌的細胞壁厚度及成分不同,因此破壁方法不同,革蘭氏陽性菌細胞壁比較厚,成分比較復雜,在破壁過程中需要加入溶菌酶。經(jīng)過多次探索我們找到了一種同時適用于兩種細菌的快速簡單的試劑盒,并對其進行了優(yōu)化,用該試劑盒分別提取了34株革蘭氏陽性菌,7株革蘭氏陰性菌的基因組,之后,用鳥槍法及mat

3、e-pair方法建庫并用Ion PGM進行測序,最后用Newbler軟件進行拼接、組裝,得到細菌全基因組序列,進行RAST注釋,序列比對等生物信息學分析。
　　由于抗生素的濫用,致病菌耐藥性越來越嚴重,細菌性疾病對人類健康造成極大威脅,噬菌體制劑作為一種新的治療手段倍受人們關注,而且隨著測序技術的不斷迅速發(fā)展,越來越多的噬菌體被測序,使得噬菌體在分子生物學研究進程中扮演著越來越重要的角色,我們采用蛋白酶K/SDS方法分別提取了27

4、株噬菌體基因組,然后進行了Ion Torrent文庫構建及上機測序,最后測序數(shù)據(jù)用軟件進行拼接,得到了噬菌體全基因組序列并注釋。
　　動物病毒是指感染動物和人類細胞并在其中進行繁殖的病毒。我們以11株禽流感病毒(RNA病毒)和1株腺病毒(DNA病毒)為對象,研究動物病毒全基因組深度測序的方法,首先,分別將其細胞培養(yǎng)液離心,過濾去除宿主細胞,DNase和RNase消化去除宿主游離核酸,超濾濃縮病毒,提取核酸,然后進行一步法擴增、MD

5、A擴增、混合引物擴增、PCR擴增等擴增方法的探索,最后將擴增產(chǎn)物純化,建庫,上機測序,獲得全基因組序列,進行遺傳進化等分析。
　　綜上所述,本研究總共測定了41株純培養(yǎng)細菌的全基因組序列,包括34株革蘭氏陽性細菌和7株革蘭氏陰性細菌,還測定了39株純培養(yǎng)病毒全基因組序列,包括27株噬菌體、11株禽流感病毒(RNA病毒)和1株腺病毒(DNA病毒)。建立了對不同類型純培養(yǎng)微生物采用不同的核酸提取、文庫構建方法及擴增方法,對這些微生物的