膽總管結(jié)石患者膽道和阿爾茨海默癥小鼠腸道的宏基因組學研究.pdf

1、越來越多的證據(jù)表明人體微生物組與人類健康和疾病關(guān)系密切，這些寄居于人體的微生物通過其代謝產(chǎn)物和免疫調(diào)節(jié)作用與宿主相互作用，從能量攝取、新陳代謝、免疫系統(tǒng)發(fā)育等多個方面對宿主產(chǎn)生深遠影響。諸如肥胖、2型糖尿病、炎性腸病等多種疾病均被發(fā)現(xiàn)與人體微生物組有相關(guān)性。近年來，伴隨著新一代高通量測序技術(shù)的高速發(fā)展，宏基因組測序技術(shù)已成為研究微生物群體的重要手段。該技術(shù)避免了如微生物培養(yǎng)技術(shù)、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reac

2、tion，PCR)擴增技術(shù)和系統(tǒng)發(fā)生芯片技術(shù)等傳統(tǒng)微生物鑒別技術(shù)存在的不足，實現(xiàn)了大規(guī)模并行測序，測序通量和測序精度更高，其足以描述微生物群體全貌。當前已通過宏基因組測序手段對人類的胃腸道、皮膚、陰道、口腔和鼻腔等多個部位的微生物群體進行了研究，為研究人體微生物組與人類健康和疾病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。但是，由于樣本采集、數(shù)據(jù)分析等方面的問題，對于某些特定人類疾病的相關(guān)微生物組研究依舊很少，導致我們對相關(guān)微生物組的構(gòu)成、功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展

3、過程中作用的認識還不夠深刻。
　　基于宏基因組測序手段，本論文第一、二部分將對前人研究極少的膽總管結(jié)石患者膽道微生物菌群進行探索，包括菌群構(gòu)成、新膽道菌發(fā)現(xiàn)、菌群功能基因和膽道菌群同其他上消化道菌群的聯(lián)系。而在第三部分，作為人類微生物組研究的補充，阿爾茨海默癥模型小鼠的腸道微生物組將被初步研究。
　　現(xiàn)有的膽總管結(jié)石患者膽道菌群多依賴于微生物培養(yǎng)和 PCR擴增技術(shù)。當前尚無膽總管結(jié)石患者膽道菌群的系統(tǒng)性研究。本論文對15位中

4、國膽總管結(jié)石患者的膽總管膽汁樣本進行全宏基因組鳥槍法(whole-metagenome shotgun，WMS)測序和16S核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)擴增子測序(簡稱16S測序)分析。這是首次對膽總管膽汁樣本進行的全宏基因組鳥槍法測序研究。平均每個樣本得到了7.29Gbp的WMS測序數(shù)據(jù)，經(jīng)過質(zhì)控和比對分析，宿主序列占所有質(zhì)控后序列的百分比均在98％以上，每個樣本包含的細菌序列數(shù)介于593和1,242,270之

5、間?；诰航Y(jié)構(gòu)分析和聚類分析，我們發(fā)現(xiàn)大部分膽總管結(jié)石患者(13/15)依據(jù)腸道菌群的豐度可以聚成兩大類：一類中既包含口腔、呼吸道細菌，也包含腸道細菌，細菌序列占測序數(shù)據(jù)的比例介于0.62%和1.66%之間；另一類中以口腔、呼吸道細菌為主，僅包含兩個腸道細菌，細菌序列比例介于0.0008%和0.056%之間。因此可以看出，在膽汁樣本中，口腔、呼吸道細菌比腸道細菌更為普遍。并且結(jié)合樣本臨床信息，我們發(fā)現(xiàn)這兩個菌群聚類均與病人的發(fā)熱狀態(tài)或

6、經(jīng)內(nèi)鏡逆行性胰膽管造影術(shù)手術(shù)史無關(guān)。此外，結(jié)果表明，膽道菌群具有明顯的個體異質(zhì)性，有許多細菌僅在一位患者(n=77)或兩位患者(n=43)的樣本中出現(xiàn)。WMS測序和16S測序結(jié)果均表明膽汁微生物組的樣本內(nèi)多樣性低于健康人腸道菌群的。借助于WMS測序的優(yōu)勢，本研究一次就發(fā)現(xiàn)了13個之前未報道的膽道細菌，比如魚腥味錐形桿菌和纖維化纖維微細菌。這些細菌的基因組覆蓋度介于1%和33.13%之間，大部分是人類口腔細菌和環(huán)境細菌。本研究還從測序數(shù)據(jù)

7、中鑒別出與膽石形成和膽汁耐受相關(guān)的基因，比如編碼β-葡萄糖醛酸酶、磷脂酶和多重耐藥外排泵蛋白的基因。同時，本研究重構(gòu)了膽道菌群的代謝通路，并與健康人腸道菌群的通路譜進行了比較，結(jié)果表明膽汁樣本中炎癥、氧化應激和鞭毛組裝相關(guān)通路豐度上調(diào)，但是碳水化合物代謝相關(guān)通路卻表現(xiàn)出不同的變化模式。
　　為了進一步研究膽道細菌的來源，我們接著對6位膽總管結(jié)石患者的膽總管膽汁、十二指腸液、胃液和唾液進行宏基因組分析?；?6S rRNA擴增子測序

8、，平均每個樣本得到了12,299條高質(zhì)量序列。在23個樣本中一共檢測到1,398個可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。分析結(jié)果表明在膽汁出現(xiàn)的細菌均出現(xiàn)在上消化道中，在門水平鑒定出的7種膽道細菌均能在同一病人的一個或多個上消化道位點中檢測到。在屬水平，膽汁中出現(xiàn)的53個高豐度細菌也均包含在上消化道菌群中?；谙嚓P(guān)性和菌群多樣性指標，本研究把膽道菌群與上消化道各取樣位點的菌群相比，發(fā)現(xiàn)膽道菌群與

9、十二指腸菌群相似度最高。我們還觀察到膽道菌群相對于上消化道菌群出現(xiàn)了不同的變化模式。雖然大部分細菌，比如普氏菌屬、韋榮球菌屬、卟啉單胞菌屬和羅氏菌屬，在膽汁中的豐度明顯降低，但仍有3個腸桿菌科細菌(埃希氏菌屬、克雷伯菌屬和一種未定義細菌)和錐形桿菌屬在膽汁中豐度上升。基于16S測序數(shù)據(jù)功能預測軟件，本研究預測出各取樣位點的代謝通路豐度，比較結(jié)果表明膽道菌群其環(huán)境信息處理能力和細胞活動能力有所增強。此外，涉及到碳水化合物、脂類、氨基酸、核

10、酸、輔助因子和維生素的代謝通路在不同取樣位點出現(xiàn)了豐度差異，表明膽道細菌可能與上消化道細菌擁有不同的能量和營養(yǎng)來源。這些結(jié)果為膽道細菌可能來自腸道細菌的逆行感染提供了直接證據(jù)，并且刻畫了膽道環(huán)境可能對細菌施加的選擇性壓力。
　　此外，為了研究阿爾茨海默癥相關(guān)微生物組，本研究還對散發(fā)性阿爾茨海默癥小鼠的腸道菌群進行了宏基因組分析，并且驗證了中藥 LW-AFC對小鼠認知功能和腸道菌群的影響。Morris水迷宮實驗、穿梭箱實驗和新奇物識

11、別實驗等一系列行為學測試實驗表明，疾病組SAMP8小鼠在空間學習和記憶能力、主動回避反應能力及物體識別記憶能力等方面存在認知功能損害，而 LW-AFC具有改善阿爾茨海默癥小鼠出現(xiàn)的認知功能障礙的功能。基于16S測序，平均每個樣本得到160,684條原始序列。在這些樣本中，一共檢測到13,727個OTU。小鼠腸道菌群的比較表明，用藥組SAMP8小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組SAMR1小鼠的更類似。在屬分類水平，與對照組SAMR1小鼠相比，疾病

12、組SAMP8小鼠的腸道微生物組中有8個豐度顯著上調(diào)的OTU和12個豐度下調(diào)的OTU。而與未用藥的疾病組SAMP8小鼠相比，用藥組SAMP8小鼠其腸道菌群也有20個具有豐度差異的OTU，其中15個豐度增加，5個豐度下降。在所有的差異OTU中，有13個OTU的豐度被LW-AFC反向調(diào)節(jié)，即疾病組SAMP8小鼠相對于SAMR1小鼠豐度增加或降低的OTU，其豐度在用藥組小鼠中分別反向降低或增加。此外，相關(guān)性分析表明，在屬水平，共計有18個屬與小

13、鼠的至少一種認知能力有關(guān)，其中有7個屬與所有3種認知能力顯著相關(guān)，并且值得注意的是，這7個屬的豐度均被LW-AFC反向調(diào)節(jié)。結(jié)果表明，疾病組SAMP8小鼠相對于對照組小鼠而言其腸道菌群出現(xiàn)了顯著變化，而且 LW-AFC可能具有修復這種菌群失調(diào)的能力。
　　總的來說，本文基于宏基因組測序技術(shù)刻畫了相應疾病狀態(tài)下膽道和腸道微生物組的構(gòu)成和功能，為進一步研究微生物組在疾病發(fā)病中的作用奠定了基礎(chǔ)。主要有以下創(chuàng)新點：本論文首次系統(tǒng)獲得膽總管

14、膽汁菌群構(gòu)成情況，一次就發(fā)現(xiàn)了前人沒有報道過的13種膽道細菌，并發(fā)現(xiàn)了菌群結(jié)構(gòu)存在兩種主要的分型，同時鑒別出菌群功能基因，重構(gòu)菌群代謝通路網(wǎng)絡，這些研究都是前人未曾做過的；首次通過對6位膽總管結(jié)石患者的膽總管膽汁與其他三個上消化道位點的比較，為醫(yī)學界一直爭論的膽道細菌的來源提供了證據(jù)，同時初步揭示了膽道環(huán)境對菌群的影響；此外，對阿爾茨海默癥小鼠的腸道菌群的研究表明，疾病組小鼠相對于對照小鼠出現(xiàn)了菌群失調(diào)，而且 LW-AFC可能具有修復這