宏基因組學(xué)技術(shù)在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、環(huán)境微生物是地球上種類最多、數(shù)量最大、分布最廣的生物類型，據(jù)估計(jì)，地球上存在超過(guò)1030個(gè)微生物。微生物的傳統(tǒng)研究方法主要是基于微生物純培養(yǎng)和分離，到目前為止，絕大多數(shù)微生物（99％以上）無(wú)法依靠上述方法獲得，這極大地限制了對(duì)微生物的研究。借助于高通量測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展起來(lái)的宏基因組學(xué)，在病原體檢測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。
　　宏基因組測(cè)序無(wú)需篩選得到各微生物群落的純培養(yǎng)物，而是直接測(cè)定樣品中所有微生物的核酸序列，這樣可避免實(shí)驗(yàn)污

2、染帶來(lái)的偏差。宏基因組學(xué)的研究主要有16S rDNA測(cè)序和全基因組測(cè)序兩種。16S rDNA測(cè)序以環(huán)境樣品中的16S rDNA為研究對(duì)象，全基因組測(cè)序(whole genome sequencing)只需直接提取出微生物基因組進(jìn)行測(cè)序。
　　本研究基于宏基因組測(cè)序，探索未知病因樣本中可能存在的致病微生物，為揭示疾病的發(fā)生和發(fā)展提供線索。
　　我們提取10份爛腳病樣品細(xì)菌核酸，擴(kuò)增16S rDNA的V1~V2高變區(qū)，測(cè)序后分析

3、其中的菌群構(gòu)成，在所有樣本中均有檢出與傷口潰爛有關(guān)的金黃色葡萄球菌和鏈球菌。
　　16S rDNA測(cè)序有較多環(huán)節(jié)需要改進(jìn)，如細(xì)菌核酸的提取、高變區(qū)的選擇、通用引物的選擇、測(cè)序平臺(tái)的選擇以及后期數(shù)據(jù)分析策略的選擇。我們?cè)囼?yàn)了七種方法對(duì)模擬樣本進(jìn)行細(xì)菌核酸提取，測(cè)序后，分析模擬樣本中各種細(xì)菌的含量和相對(duì)分布，尋找一種廣譜、高效的細(xì)菌核酸提取方法。
　　在篩查一份未知病因發(fā)熱病人的樣品時(shí)，我們測(cè)序了其中病毒的宏基因組，發(fā)現(xiàn)了一株屬

4、于Microviridae的病毒基因組IME-16，與以往報(bào)道差異比較大，我們對(duì)其進(jìn)行了注釋、進(jìn)化分析以及結(jié)構(gòu)蛋白的分析，推測(cè)IME-16可能是與alphaviruses距離較遠(yuǎn)的一支。
　　在測(cè)序一份乙肝病人血清樣品的病毒宏基因組時(shí)，我們優(yōu)化了生物信息分析方法，加快了數(shù)據(jù)分析的速度，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些以往報(bào)道與肝炎有關(guān)的Anelloviridae病毒序列，其中共發(fā)現(xiàn)10株Torque Teno Midi Virus(TTMDV)序

5、列和3株Torque Teno Virus(TTV)序列與以往報(bào)道的序列差異大，我們對(duì)這些序列進(jìn)行注釋和進(jìn)化分析，證實(shí)它們屬于新型的Anelloviridae病毒。
　　綜上所述，我們采用宏基因組測(cè)序，篩查了一批未知病因爛腳病樣品、一份未知病因發(fā)熱血清樣品以及一份乙型肝炎病人血清樣品，發(fā)現(xiàn)了與疾病有關(guān)的致病菌以及新型病毒全基因組序列，同時(shí)，我們改進(jìn)細(xì)菌基因組提取方法和數(shù)據(jù)分析方法?？傊S著宏基因組測(cè)序方法改進(jìn)和分析技術(shù)提高，宏基