新發(fā)及罕見(jiàn)侵襲性真菌病原體的基因組研究及分子診斷.pdf

1、侵襲性真菌感染((invasive fungal infection，IFI)是指侵犯皮膚角質(zhì)層以下，粘膜、內(nèi)臟器官及深部組織，在一定條件下可播散至全身的感染，包括真菌血癥和深部組織感染。近30年來(lái)，由于艾滋病、腫瘤、糖尿病等免疫功能低下患者的增加，創(chuàng)傷性醫(yī)療操作、器官移植的增多，長(zhǎng)期使用抗生素等因素，侵襲性真菌感染的發(fā)病率和死亡率顯著上升，同時(shí)新突發(fā)的真菌侵襲病例也不斷涌現(xiàn)。相比侵襲性真菌的來(lái)勢(shì)兇猛，人們對(duì)它的研究還比較薄弱，真菌的基

2、因組測(cè)序、分子診斷、藥物開(kāi)發(fā)都相對(duì)少于對(duì)病毒及細(xì)菌的研究。本課題通過(guò)對(duì)新發(fā)及疑難罕見(jiàn)真菌病原體進(jìn)行全基因組測(cè)序分析和分子診斷方法的研究，從而達(dá)到全基因組數(shù)據(jù)的構(gòu)建、近緣種屬進(jìn)化的探究、致病相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)、可能致病機(jī)制的推測(cè)、分子診斷標(biāo)志物的預(yù)測(cè)等目的，為進(jìn)一步進(jìn)行預(yù)防、診斷、治療等研究奠定基礎(chǔ)。
　　本文建立了結(jié)合二、三代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行新發(fā)及罕見(jiàn)侵襲性病原真菌基因組de novo拼接及深度解析致病因子的方案。對(duì)于新發(fā)的侵襲性致病真菌

3、膠囊青霉（Penicillium capsulatum）和伊蒙菌新種（Emmonsia sp.5z489）在無(wú)參考基因組的情況下，首次測(cè)得他們的全基因組序列，進(jìn)行從頭拼接，得到了完整度很高的基因組圖譜，并對(duì)它們及近緣菌進(jìn)行了毒力因子的解析和進(jìn)化研究。2011年以來(lái)，以Illumina MiSeq和HiSeq為代表的第二代測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，極大提高了測(cè)序通量，縮短了測(cè)序時(shí)間，降低了測(cè)序成本，基因組學(xué)研究迎來(lái)了革命性突破。但是二代測(cè)序讀長(zhǎng)比

4、較短，這就增添了后期的序列拼接、注釋、比對(duì)等生物信息學(xué)分析的難度，尤其對(duì)于有較多重復(fù)序列的真核生物基因組的從頭拼接。以Pacbio RSII為代表的第三代測(cè)序技術(shù)具有長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，在基因組測(cè)序中能夠成功跨越重復(fù)區(qū)，降低了測(cè)序后基因組拼接、分析的工作量。但是，第三代測(cè)序的錯(cuò)誤率相比一代和二代都要顯著增加，單堿基錯(cuò)誤率可達(dá)到10~15％?？梢?jiàn)這些測(cè)序技術(shù)各有不同的優(yōu)勢(shì)與缺憾，所以對(duì)于不同的基因組研究目的，需要選擇合適的測(cè)序方案。本研究建立了

5、二、三代測(cè)序數(shù)據(jù)融合的方案解決了新發(fā)及罕見(jiàn)致病性真菌基因組的從頭拼接難題，并深入分析其遺傳信息，取得了較好的效果。
　　膠囊青霉屬于散囊菌目青霉屬，它曾用于工業(yè)造紙，以往未見(jiàn)到有致病性報(bào)道。青霉屬真菌在人們的日常生活中起著非常重要的作用，極少對(duì)人致病。本研究所涉及的膠囊青霉更是鮮見(jiàn)的由青霉引起深部侵襲性感染的案例。2013年我國(guó)真菌學(xué)家首次在一位II型糖尿病人肺部發(fā)現(xiàn)膠囊青霉感染的菌團(tuán)并進(jìn)行分離培養(yǎng)。本研究通過(guò)將二代Illumin

6、a MiSeq測(cè)序平臺(tái)與三代Pacbio RSII測(cè)序平臺(tái)相結(jié)合的技術(shù)方案，繪制它的全基因組圖譜，分析其系統(tǒng)進(jìn)化，闡明了其中容易產(chǎn)生爭(zhēng)議的分類進(jìn)化關(guān)系，為分子進(jìn)化研究提供了新的視角。并將其毒力相關(guān)因子分成7類：
　　1）與熱耐受相關(guān)的毒力因子。
　　2）與細(xì)胞壁合成及結(jié)構(gòu)相關(guān)的毒力因子。
　　3）與抵抗人體免疫系統(tǒng)相關(guān)的毒力因子。
　　4）與毒素分泌相關(guān)的毒力因子。
　　5）與侵襲宿主過(guò)程中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)

7、的毒力因子。
　　6）與信號(hào)傳導(dǎo)、適應(yīng)人體環(huán)境相關(guān)的毒力因子。
　　7）與過(guò)敏原相關(guān)的毒力因子，進(jìn)行了細(xì)致的分析，對(duì)如何研究一種新發(fā)侵襲性真菌的致病性提供了參考方案。
　　伊蒙菌是一種雙相真菌，在環(huán)境中以菌絲相存在，在哺乳動(dòng)物組織中則會(huì)形成酵母樣細(xì)胞。伊蒙菌的宿主一般是嚙齒類動(dòng)物，侵襲人類從而引發(fā)深部感染的伊蒙菌是比較罕見(jiàn)的。但是近年來(lái)新英格蘭醫(yī)學(xué)連續(xù)報(bào)道了南非 HIV感染人群被伊蒙菌深部侵襲的病案，引發(fā)了人們的高度關(guān)

8、注。我國(guó)首例伊蒙菌侵襲肺部的病案是由協(xié)和醫(yī)院于2005發(fā)現(xiàn)的?；颊咴粦岩墒欠谓Y(jié)核，但相應(yīng)治療無(wú)效，經(jīng)病原菌培養(yǎng)，通過(guò)形態(tài)學(xué)及ITS序列鑒定為是罕見(jiàn)的伊蒙菌深部感染，這個(gè)新種被命名為東方伊蒙菌，菌株號(hào)為Emmonsia sp.5z489。本研究首次將我國(guó)自主發(fā)現(xiàn)的這株侵襲性伊蒙菌新種進(jìn)行全基因組測(cè)序。仍采用二代Illumina MiSeq平臺(tái)與三代Pacbio RSII平臺(tái)相融合的方案，結(jié)合了兩者短序列深度測(cè)序和長(zhǎng)序列測(cè)序跨越重復(fù)區(qū)的優(yōu)

9、勢(shì)，可以達(dá)到高完整度和可信度的拼接結(jié)果，并基于病原體與宿主之間相互作用的毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)（Pathogen-Host Interaction database，PHI)進(jìn)行這一新種的毒力因子分析。進(jìn)而將我國(guó)新發(fā)現(xiàn)的侵襲性伊蒙新種Emmonsia sp.5z489與國(guó)際上報(bào)道的3種侵襲性伊蒙菌進(jìn)行比較，重點(diǎn)分析毒力因子的異同和進(jìn)化關(guān)系。發(fā)現(xiàn)這株?yáng)|方伊蒙菌Emmonsia sp.5z489與南非Emmonsia sp.CAC-2015的進(jìn)化關(guān)

10、系最近，它們都是侵襲人類的致病菌。而另外兩株感染動(dòng)物的伊蒙菌進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，且毒力因子的數(shù)量也少于人類致病菌。并且利用基因組數(shù)據(jù)所做的進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)分離自挪威一只倉(cāng)鼠身上的致病伊蒙菌Emmonsia parva是與芽生菌（Blastomyces）分在一個(gè)屬，這也是近年來(lái)對(duì)伊蒙菌分類爭(zhēng)議的一個(gè)焦點(diǎn)，我們的研究為國(guó)際真菌學(xué)家要求重新對(duì)Ajellomycetaceae菌科伊蒙菌屬進(jìn)行分類提供了一定的依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究侵襲動(dòng)物和人的病原菌演變

11、進(jìn)程、致病機(jī)制提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　隱球菌腦膜炎是一種非常嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，預(yù)后不良，死亡率高。致病菌主要是新生隱球菌，通常感染的是免疫缺陷人群。但從1999年以來(lái)，在加拿大不列顛哥倫比亞省、溫哥華島和美國(guó)北部等地區(qū)發(fā)現(xiàn)人類隱球菌感染的暴發(fā)流行，其病原菌不是新生隱球菌，而是格特隱球菌，這種格特隱球菌可引起免疫正常人群罹患肺炎和腦膜炎，從而越來(lái)越受到全球范圍的重視。而我國(guó)有關(guān)格特隱球菌致病機(jī)理的研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少，更鮮有基因組的

12、報(bào)道，國(guó)內(nèi)首例格特隱球菌是1980年由長(zhǎng)征醫(yī)院真菌學(xué)家廖萬(wàn)清教授報(bào)道的。本研究所獲得格特隱球菌也是由廖萬(wàn)清院士團(tuán)隊(duì)從隱球菌腦膜炎患者的腦脊液中分離培養(yǎng)得到的病原菌，本研究將其進(jìn)行深度測(cè)序，全基因組拼接，并基于病原體與宿主之間相互作用的毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行毒力因子分析。
　　由于侵襲性真菌病具有發(fā)病隱匿、臨床表現(xiàn)易被基礎(chǔ)病掩蓋、病死率與致殘率高等特點(diǎn)，早期、準(zhǔn)確的診斷對(duì)于及時(shí)救治意義重大。致病菌的分離培養(yǎng)、表型鑒定是臨床上確診IFI的

13、主要依據(jù)。但真菌培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，某些病原菌生長(zhǎng)條件苛刻，培養(yǎng)過(guò)程中容易被其他環(huán)境菌污染，并且對(duì)于己使用抗感染藥物的患者培養(yǎng)結(jié)果假陰性率很高。而分子診斷具有高效、及時(shí)、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，為侵襲性真菌的早期診斷提供了有力的依據(jù)。但是以往的分子診斷主要是依靠單個(gè)或多個(gè)序列的PCR實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定，這樣的技術(shù)已經(jīng)不能滿足判定新發(fā)及罕見(jiàn)真菌感染的需求。本研究首次利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)不可培養(yǎng)的疑難真菌侵襲病例進(jìn)行直接“從樣本到序列”的宏基因組測(cè)序方案進(jìn)行全部序列信

14、息的掃描，并進(jìn)一步用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)分離可疑病原體進(jìn)行測(cè)序、拼接、比對(duì)。最終得到了比較可靠的診斷結(jié)果，對(duì)臨床治療進(jìn)行了有效的指導(dǎo)，并對(duì)如何鑒定不可培養(yǎng)的疑難真菌病原體提供了一個(gè)新的研究方法。
　　綜上所述，測(cè)序技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展為醫(yī)學(xué)帶來(lái)了更廣闊的發(fā)展前景。侵襲性真菌的來(lái)勢(shì)兇猛提示我們要以更先進(jìn)更精準(zhǔn)的方法去認(rèn)識(shí)、預(yù)防、診治深部真菌感染。本課題利用二、三代測(cè)序技術(shù)，通過(guò)對(duì)新發(fā)及罕見(jiàn)侵襲性真菌病原體的基因組研究及分子診斷，為加深對(duì)真菌