四個玉米及其野生材料BAC基因組文庫的構建和分析.pdf

1、玉米是世界上最重要的農作物之一，它不但為人類提供食物，同時也是優(yōu)質的飼料，更是多種工業(yè)制品如酒精，淀粉的原料。育種家更是培育出了眾多特用玉米，大大擴展了玉米的用途。遺傳學和基因組學中的很多現象如轉座子，表觀遺傳和雜種優(yōu)勢等都首先在玉米中被發(fā)現。玉米的基因組表現出復雜和多樣化的特點，是其它大型植物基因組測序和基因組進化的模式植物。世界上玉米的種質資源非常豐富，它們的野生近緣材料，大芻草和摩擦禾更是包含眾多優(yōu)良性狀及生物和非生物抗性的基因寶

2、庫。開發(fā)和解讀玉米及其野生材料的基因組資源的第一步是構建大片段基因組的細菌人工染色體文庫(bacterialartificialchromosomelibrary,BACLibrary)，構建高質量的物理圖譜，進而得到全基因組序列。還可以同時將篩選到的包含重要農藝性狀基因或基因家族的大片段直接進行植物轉化來研究基因的功能?？紤]到開發(fā)玉米及其野生資源的重要性以及BAC文庫在基因組學研究中的重要作用，本研究構建了四個玉米及其野生材料的BAC

3、文庫，并對這些文庫進行了質量檢測。對兩個野生玉米材料進行了初步分析。
　　四個玉米及其野生材料分別是自交系鄭58和昌7-2，大芻草Parviglumis(Zeamaysssp:Parviglumis)，摩擦禾Tripsacum（Tripsacumdactyloides）。鄭58和昌7-2是中國種植面積最廣的雜交種鄭單958的雙親，包含了眾多優(yōu)良農藝性狀基因。Parviglumis是栽培玉米的祖先，TripsacumL.在玉蜀黍族里

4、面距離玉蜀黍屬親緣關系最近，也和玉米的起源有關。Parviglumis和Tripsacum都是巨大的基因寶庫，它們代表著還未開發(fā)的與農作物改良相關的遺傳資源。本實驗針對以上四種材料的研究結果如下:
　　1.構建了兩個玉米自交系（鄭58和昌7-2）以及兩個玉米野生材料（Parviglumis和Tripsacum）的BAC文庫。這四個BAC文庫都是用HindⅢ部分酶解，連接到pIndigoBAC536-SBAC載體上。鄭58的BAC文

5、庫包含148，992個克隆，平均插入片段為144kb，細胞器DNA污染率為0.55％，基因組覆蓋度為8.4倍。昌7-2的BAC文庫包含145，920個克隆，平均插入片段為139kb，細胞器DNA污染率為0.58％，基因組覆蓋度為8.0倍。Parviglumis的BAC文庫包含100，608個克隆，平均插入片段為148kb，細胞器DNA污染率為0.31％，基因組覆蓋度為5.5倍。Tripsacum的BAC文庫包含128，256個克隆，平均

6、插入片段為139kb，細胞器DNA污染率為0.26％，基因組覆蓋度為4.7倍。
　　2.選擇了12個玉米B73的單拷貝基因，分別分布在玉米的10條染色體上。用該12個基因作探針，對Parviglumis和TripsacumBAC文庫進行篩選。12個基因在兩個野生玉米BAC文庫中都篩選到了陽性克隆，說明這兩個野生玉米文庫可以用來篩選目的基因。兩個玉米自交系鄭58和昌7-2的BAC文庫因為擁有更高的基因組覆蓋度，篩選到目的基因的可能性

7、更大。
　　3.對4個位點，adh1，adh2，tb1，ba1上下游基因進行PCR擴增，利用這些基因探針對Parviglumis和TripsacumBAC文庫進行篩選。一共篩選到120個克隆（Parviglumis）和159個克?。═ripsacum）。對這些克隆通過fingerprinting進行contig拼裝，以備后續(xù)測序分析。
　　4.對來自兩個野生玉米文庫的442個克隆進行末端測序，有88％的末端序列測序成功。對1

8、2個基因探針篩選到的陽性克隆通過fingerprinting進行contig拼裝。Parviglumis文庫中共有64個克隆拼裝成了20個contigs，Tripsacum文庫中共有85個克隆拼裝成了27個contigs。用一個contig表示一個位點來估算基因組的覆蓋度，ParviglumisBAC文庫的基因組覆蓋度為3.2倍，而TripsacumBAC文庫的基因組覆蓋度為3.1倍。
　　5.我們嘗試利用BAC末端序列將Parv

9、iglumisBAC文庫中篩選到的陽性克隆錨定到玉米B73的參考序列上。Parviglumis中有102個克隆的BESs在B73參考序列上有錨定位點。成功測得202條BESs，有196條BESs在B73參考序列上有錨定位點。有70個克隆可以錨定到參考序列上。其中有18個克隆能夠拼裝成contig，并且錨定到預期的位置。一共有9個contig可以錨定到參考序列上。
　　6.我們嘗試利用BAC末端序列將TripsacumBAC文庫中篩

10、選到的陽性克隆錨定到玉米B73參考序列上。Tripsacum中有104個克隆的BESs在B73參考序列上有錨定位點。成功測得229條BESs，有150條BESs在B73參考序列上有錨定位點。有22個克隆可以錨定到參考序列上。其中有5個克隆能夠拼裝成contig，并且錨定到預期的位置。一共有3個contig可以錨定到參考序列上。
　　7.分析能夠錨定到B73參考序列上的adh1contig。通過用Ⅰ-SceⅠ酶切BAC克隆，用脈沖場