五指山小型豬基因組BAC文庫的構(gòu)建與北京油雞風(fēng)味特性基因的研究.pdf

1、抽取一只雄性五指山小型豬靜脈血，用于制備大分子量基因組DNA，制備好的基因組DNA經(jīng)HindⅢ部分酶切后，二次脈沖電泳分離所需DNA片段。電洗脫回收100～400kb范圍的片段，然后與pBeoBACll載體連接，轉(zhuǎn)化DHlOB感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過培養(yǎng)，挑取和保存白色單克隆?；蚪M文庫的質(zhì)量一般從文庫的平均插入、基因組覆蓋率、嵌合率二方面來衡量。本研究所構(gòu)建中國特有五指山小型豬基因組BAC文庫，含有153，600個BAC克隆(保存在40個超級

2、池，每個超級池由10個384孔板組成)。隨機(jī)挑選了270個BAC克隆的插入片段進(jìn)行估計(jì)，平均為152.3kb，其中空克隆的比例為1.3％，表明文庫的覆蓋率7.4倍，預(yù)計(jì)從文庫中篩選到單拷貝基因的機(jī)率為99.93％。文庫中78％的克隆插入大于100 kb，而且有部分克隆甚至大于300kb，這樣大小的插入可以滿足所有試驗(yàn)對于片段大小的要求。從各個方面來看，本文構(gòu)建的文庫都適用于功能基因和物理圖譜構(gòu)建的研究。 構(gòu)建北京油雞成纖維靶細(xì)胞

3、系，細(xì)胞凍存?zhèn)€體數(shù)達(dá)45個，凍存細(xì)胞支數(shù)達(dá)170支，每支細(xì)胞含量為3～5×106細(xì)胞/ml，保證北京油雞遺傳基因的群體多樣性，同時為外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)提供了良好的體外培養(yǎng)靶細(xì)胞。使北京油雞這一國家重要遺傳資源在細(xì)胞水平上得以保存下來，并為相關(guān)遺傳學(xué)研究提供了有效的理論依據(jù)和理想的生物材料。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)菌、真菌、支原體檢測、生長曲線、核型分析及同工酶檢測等多項(xiàng)細(xì)胞系質(zhì)量檢測，結(jié)果表明建立的北京油雞成纖維細(xì)胞系性質(zhì)穩(wěn)定，生物學(xué)

4、性能正常，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到美國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞系鑒定標(biāo)準(zhǔn)。利用6種熒光蛋白基因在所建細(xì)胞系中得到良好的表達(dá)，說明細(xì)胞具有良好的被轉(zhuǎn)染能力，從基因表達(dá)的水平上進(jìn)一步確定細(xì)胞系的遺傳性能良好，為進(jìn)行北京油雞風(fēng)味特色功能基因的表達(dá)、定位和克隆化細(xì)胞的篩選鑒定了基礎(chǔ)。 采用RT-PCR與RACE方法擴(kuò)增出北京油雞腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)基因全長cDNA序列，該基因開放閱讀框長為1455個堿基，編碼485個氨基酸；構(gòu)建成北京油雞

5、ADSL基因融合表達(dá)載體pGEX-ADSL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示重組融合蛋白在分子量約為80.5kD處有特異的蛋白條帶，與預(yù)期分子量大小一致，等電點(diǎn)為6.79。該蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間的延長而增加，5h達(dá)最高值，達(dá)到細(xì)胞總蛋白的26.9％，且主要以不可溶的包涵體形式存在，經(jīng)Glutathione Sepharase 4B凝膠純化后用Western-blotting檢測表明其為北京油

6、雞ADSL蛋白，為其進(jìn)一步的具有生物學(xué)功能研究及其應(yīng)用鑒定了基礎(chǔ)。提取北京油雞心、肝、脾、肺、腎、腦、腿肌與胸肌等不同組織的總RNA，利用RT-PCR方法擴(kuò)增檢測purH基因mRNA的差異表達(dá)水平。構(gòu)建帶有熒光蛋白報告基因的真核重組表達(dá)載體pEGFP-N3-purH，pEYFP-N1-purH和pDsRedl-N1-purH。并利用G418藥物篩選和對熒光強(qiáng)度高的單克隆化培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在轉(zhuǎn)染后24、48和72h，重組融合蛋白轉(zhuǎn)染率在1

7、0.3％～53.2％之間。pEGFP-N3-purH，pEYFP-N-purH與pDsRed-N1-purH在北京油雞成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布，呈彌散分布。經(jīng)藥物篩選和單克隆化培養(yǎng)，獲得表達(dá)pEGFP-N3-purH，pEYFP-N1-purH與pDsRed-N1-purH融合蛋白的陽性克隆細(xì)胞株，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增與Western blot檢測確認(rèn)了purH融合蛋白基因已經(jīng)整合到北京油雞成纖維細(xì)胞的基因組中，獲得正常表達(dá)。

8、 本研究構(gòu)建了高質(zhì)量的五指山小型豬基因組BAC文庫，從全基因組水平上保存了五指山豬的遺傳資源，為功能基因組學(xué)研究和后基因組學(xué)研究提供了重要的試驗(yàn)材料和實(shí)物基礎(chǔ)。創(chuàng)建的北京油雞成纖維靶細(xì)胞系從細(xì)胞水平保存了北京油雞的基因資源，同時為風(fēng)味特色基因的表達(dá)提供重要的靶細(xì)胞。由于供體細(xì)胞的質(zhì)量對于轉(zhuǎn)基因動物克隆非常重要，本研究利用抗性篩選和克隆化培養(yǎng)獲得北京油雞ADSL基因1株與purH基因3株的陽性細(xì)胞株，一方面為北京油雞轉(zhuǎn)基因動物克隆提