大豆抗原蛋白誘發(fā)五指山小型仔豬過敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

1、大豆蛋白大豆蛋白glycinin和?conglycinin經(jīng)口誘發(fā)五指山小型豬過敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)口誘發(fā)五指山小型豬過敏反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究黃瓊1徐海濱2楊杏芬1黃俊明1于州2高芃2劉珊2廣東省疾病預(yù)防控制中心毒理實(shí)驗(yàn)所，廣州510300摘要：目的摘要：目的建立適用于評價(jià)食物中潛在致敏物質(zhì)的五指山小型豬大豆球蛋白（11S）和β伴球蛋白（7S）經(jīng)口致敏模型。方法方法20頭1.5月齡五指山小型豬分別攝入含0％、4％11S、8％11S、4％7S、8

2、％7S大豆蛋白的飼料，通過胃腸道致敏(010d)和反復(fù)經(jīng)口激發(fā)(1618d31d)誘導(dǎo)致敏反應(yīng)，從皮膚試敏反應(yīng)、血清IgG、IgE和組胺水平、小腸組胺含量和肥大細(xì)胞數(shù)量、外周血淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子表達(dá)等方面進(jìn)行模型評價(jià)和可能致敏機(jī)制的探討。結(jié)果結(jié)果接受11S或7S經(jīng)口致敏的仔豬皮膚試敏試驗(yàn)呈不同程度的陽性反應(yīng)；致敏組仔豬血清中IgG、IgE抗體和組胺含量在第19d即激發(fā)期后達(dá)到最高，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)仔豬血清中IgG、IgE抗體和組胺含量兩兩

3、呈正相關(guān)；實(shí)驗(yàn)第19d4％11S和4％7S致敏組血清中IgG、IgE抗體和組胺含量均高于對照組，第32d4％11S和4％7S致敏組IgE抗體和4％11S致敏組IgG抗體和組胺含量均高于對照組；空腸組胺含量與十二指腸組胺、回腸組胺含量呈正相關(guān)，而與空腸粘膜層和粘膜下層肥大細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)；4％7S致敏組空腸組胺高于對照組，4％11S致敏組空腸粘膜下層肥大細(xì)胞數(shù)目低于對照組；實(shí)驗(yàn)第19d4％7S致敏組血清中IFN?含量較對照組降低；實(shí)驗(yàn)終期8

4、％11S致敏組外周血CD4CD8比值較對照組升高，以上差異比較或相關(guān)性檢驗(yàn)均有顯著性意義（P0.05或0.01）。結(jié)論結(jié)論由大豆蛋白glycinin和βconglycinin誘發(fā)的五指山小型豬食物致敏模型屬IgE介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng)類型，可用于食物潛在致敏性的評價(jià)。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：食物過敏大豆球蛋白大豆伴球蛋白五指山小型豬ExperimentalstudiesofanaphylacticreactionsinWZSminipigallyi

5、nducedbysoybeanglycinin?conglycininHUANGQiongXUHaibinYangXingfenHuangJunmingYuZhouGAOPengLiuShanInstituteofToxicologyCenterfDiseaseControlPreventionofGuangdongProvinceGuangzhou510300China基金項(xiàng)目：國家科技部973計(jì)劃（No:2007CB109207）通

6、訊作者簡介：徐海濱，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品毒理學(xué)，轉(zhuǎn)基因食品安全性評價(jià)，Email：hbxu1231602@vip.1廣東省疾病預(yù)防控制中心2中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所合制訂的判定樹分析法(decisiontreeapproach)[5]，該方法包括結(jié)構(gòu)分析和氨基酸序列比較；理化特性研究如消化穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)在食物中的含量及消費(fèi)模式等。2001年FAOWHO在該判定樹的基礎(chǔ)上進(jìn)行了發(fā)展和完善主要增加了靶

7、血清篩選試驗(yàn)和動物模型試驗(yàn)內(nèi)容并認(rèn)為食物致敏動物模型是評價(jià)其潛在致敏性最直接的方法再次肯定了開展食物致敏動物模型研究的必要性和意義[6]。研究至今，食物致敏動物模型主要用于驗(yàn)證過敏性疾病的免疫治療物質(zhì)有效性和預(yù)測對人類有潛在致敏性的物質(zhì)兩方面。動物種屬涵蓋嚙齒類動物和非嚙齒類動物，前者主要是小鼠、大鼠和豚鼠，后者包括狗、豬等。目前國際上尚未建立食物致敏性評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)動物模型，實(shí)際上任何單一模型不可能適用所有目的，至今也未發(fā)現(xiàn)一種可重復(fù)2～

8、3種以上常見食物致敏原在人體引起的過敏反應(yīng)的動物模型，關(guān)鍵是要根據(jù)研究目的和各種模型特點(diǎn)進(jìn)行針對性地選擇[7]。比如嚙齒類動物模型多適用于分子和細(xì)胞水平的致敏機(jī)制研究，并具有費(fèi)用少、易獲得和易操作的優(yōu)勢。而在進(jìn)行過敏性疾病研究，如更多關(guān)注皮膚、呼吸道和胃腸道等臨床癥狀的改變則可考慮使用大動物如豬和狗等作為模型。近年來，一些非嚙齒類大動物如豬和狗等，由于諸多優(yōu)勢逐漸被食物致敏研究者們關(guān)注和利用：(1)確認(rèn)的對天然過敏食物的臨床和免疫學(xué)表現(xiàn)

9、；(2)與人類更近似的解剖學(xué)、生理學(xué)和營養(yǎng)需要特點(diǎn)；(3)與人類更近似的免疫病理學(xué)、機(jī)制學(xué)和治療性干預(yù)策略；(4)可反復(fù)多次胃腸道內(nèi)窺鏡觀察；(5)可獲得大量免疫器官或細(xì)胞進(jìn)行研究；(6)可減少單位體重致敏原使用濃度。當(dāng)然這些大動物研究的一些缺點(diǎn)也是易見的，主要集中在種屬與品系的有限性，基因敲除品系尚不可得，免疫方法研究試劑的缺乏，大體積而小樣本以及較為昂貴的費(fèi)用等方面[8]。與其它動物模型比較，豬在研究致敏原發(fā)病機(jī)理和免疫應(yīng)答等方面有

10、許多更重要的優(yōu)點(diǎn)。除與人類在胃腸道生理學(xué)和黏膜免疫發(fā)育上的極相似性外，同時(shí)由于具有先天免疫反應(yīng)活性使得利用豬進(jìn)行免疫反應(yīng)評價(jià)更為有效和可能。目前進(jìn)行豬的致敏模型研究只在個(gè)別實(shí)驗(yàn)室開展[910]，利用豬致敏模型篩選轉(zhuǎn)基因食品的潛在致敏性尚未見研究報(bào)道。大豆作為一種優(yōu)質(zhì)植物性蛋白原料，已被廣泛應(yīng)用食品和動物飼料生產(chǎn)中，但由于其含有的多種抗?fàn)I養(yǎng)成分影響了其進(jìn)一步的開發(fā)和利用。大豆抗原蛋白是大豆中最主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，而大豆球蛋白（glycini

11、n）和?伴球蛋白（?conglycinin）是兩種免疫原性最強(qiáng)的大豆抗原蛋白，諸多研究對兩者的免疫血特性和致敏性作了廣泛研究，現(xiàn)已明確這兩種蛋白是引起動物大豆過敏反應(yīng)的主要物質(zhì)[11]。本研究以我國自主馴化和成功培育的實(shí)驗(yàn)用近交系五指山小型豬作為模式動物，采用大豆抗原蛋白glycinin和?conglycinin作為陽性致敏物，建立適用于評價(jià)食物中潛在致敏物質(zhì)致敏性的大動物模型，旨在為我國建立轉(zhuǎn)基因食品致敏性的評價(jià)程序提供一定理論依據(jù)和

12、實(shí)驗(yàn)參考。1材料與方法材料與方法1.1大豆抗原蛋白大豆抗原蛋白純化的大豆提取物glycinin（以下簡稱11S）和?conglycinin（以下簡稱7S）蛋白由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院郭順堂教授惠贈（專利號為：No200410029589.4），冷凍干燥磨粉后4℃冷藏保存，經(jīng)SDSPAGE電泳和考馬斯亮蘭染色后分析，純度分別為85％和80％。1.2動物和飼料動物和飼料20頭（4窩5頭）五指山小型豬仔豬由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提