未培養(yǎng)海洋微生物延胡索酸還原酶的基因克隆、表達(dá)及生化性質(zhì)鑒定.pdf

1、延胡索酸還原酶(fumarate reductase，EC1.3.1.6)，主要催化延胡索酸還原生成琥珀酸，是很多生物厭氧呼吸系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶。該酶廣泛存在于革蘭氏陰性菌、兼性厭氧革蘭氏陽(yáng)性菌以及一些綠藻、原生動(dòng)物、寄生蠕蟲(chóng)和低等海洋等真核生物中。不僅可應(yīng)用于多種人類(lèi)疾病治療，且其產(chǎn)物琥珀酸也有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。本研究主要研究了從廣西北部灣海洋微生物宏基因組文庫(kù)中得到的一個(gè)具有延胡索酸還原酶功能的陽(yáng)性克隆(pGXAR313G)，其攜帶的

2、外源DNA片段包含一個(gè)可能編碼延胡索酸還原酶的新基因，該基因被命名為frd1A。
　　 通過(guò)生物信息學(xué)分析表明，frd1A基因含有444個(gè)堿基對(duì)，編碼147個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.59，相對(duì)分子質(zhì)量為16.11 kDa。通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，在核苷酸水平上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)已知的基因存在相似性，但是在氨基酸水平卻與一種延胡索酸還原酶(Runellaslithyformis YP_004658175)的B亞基相似性為82%，一致

3、性為69%。在第56-64個(gè)氨基酸中，有一個(gè)2Fe-2S鐵氧還蛋白結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)是其保守結(jié)構(gòu)域。
　　 利用DNA重組技術(shù)，將frd1A基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pETBlue-2重組后導(dǎo)入到Escherichia coli Tuner(DE3)pLacI細(xì)胞中，得到重組表達(dá)菌株E.coli Tuner(DE3)pLacI/pGXAR313G。并在最適條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到重組產(chǎn)物蛋白Frd1A，利用鎳柱親和層析技術(shù)完成了重組蛋白的分離純

4、化，完成了重組蛋白的功能鑒定和生化性質(zhì)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)蛋白的最適反應(yīng)溫度為28℃，最適作用pH為7.0；最適條件下的酶活力為9.59 U/mL，比活力為10.644 U/mg。通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，測(cè)得其Km值為0.227 mM，Vmax為29.94 mM/min，kcat值為12.35 s-1；Zn2+、Mg2+對(duì)酶反應(yīng)有促進(jìn)作用，Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、SDS和EDTA則表現(xiàn)為抑制作