編碼磷酸酯酶新基因的克隆、表達(dá)及產(chǎn)物的生化性質(zhì)鑒定.pdf

1、磷酸酯酶廣泛存在于生物體內(nèi)，在生物的磷代謝中起到重要的作用。在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中控制蛋白的磷酸化，協(xié)調(diào)組織生理生化功能。由于其來(lái)源不同，具有不同的特性而被廣泛應(yīng)用與分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中。本研究對(duì)來(lái)自于堿性污染土壤宏基因組文庫(kù)中的表達(dá)磷酸酯酶活性的陽(yáng)性克隆pGXA1009進(jìn)行了亞克隆并序列分析，得到可能編碼磷酸酯酶基因的開放閱讀框，將其命名為phop1。
　　 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，phop1是由1389個(gè)堿基對(duì)

2、組成，編碼463個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量約51451.79 Da，理論等電點(diǎn)pI為6.26。該基因在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸水平上與已知的基因沒(méi)有相似性，在氨基酸水平上，Phop1與來(lái)自Thermincola potens(登錄號(hào)：YP003639845.1)的含PHP域磷酸酯酶蛋白的一致性為28%，相似性為45%。氨基酸序列分析比較結(jié)果表明，Phop1與PHP域家族蛋白的保守基序具有一定的相似性，可能具有磷酸酯酶功能。由此我

3、們鑒定Phop1可能為PHP蛋白家族的新成員。
　　 我們對(duì)phop1基因的ORF進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與表達(dá)載體pETBlue-2連接并導(dǎo)入表達(dá)宿主細(xì)胞Rosetta-gamiTM2(DE3)placI進(jìn)行目的基因的過(guò)量表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示得到了與預(yù)測(cè)分子量大小一致的蛋白條帶。對(duì)重組蛋白Phop1進(jìn)行了生化性質(zhì)研究，以pNPP為底物，發(fā)現(xiàn)Phopl的最適pH為6.0，最適作用溫度為50℃，該酶對(duì)高溫表現(xiàn)有

4、一定適應(yīng)性和熱穩(wěn)定性。在最適條件下的測(cè)得酶活力為1.21U/mg，采用Lineweaver-Burk作圖法，Phopl的表觀米氏常數(shù)Km為0.130 mM，最大反應(yīng)速率Vmax為35.2μM/min，Na2HPO4對(duì)酶的抑制作用為線性競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制常數(shù)Ki約為0.952 mM。Mg2+和Co2+在0.5-2 mM范圍內(nèi)對(duì)Phop1的酶活有一定的促進(jìn)作用，EDTA作用呈明顯的抑制性。本研究通過(guò)完成未培養(yǎng)微生物編碼磷酸酯酶的新基因的功能鑒