番茄景天庚酮糖-1,7-二磷酸酯酶基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、番茄（Lycopersicon esculentum）是我國主要的設(shè)施蔬菜，屬于冷敏感和喜光植物。景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶（SBPase）位于Calvin循環(huán)的再生和同化階段的分支點上，對維持Calvin循環(huán)中RuBP的再生以及碳源的流通具有十分重要的作用。盡管SBPase在植物體內(nèi)含量很低，卻是限制RuBP再生速率的關(guān)鍵酶。通過基因工程的手段提高光合酶的含量和活性，對改良作物的光合能力具有重要意義。
　　 本研究以番茄為試

2、材，克隆SBPase基因，分析其在番茄中的內(nèi)源表達特性和晝夜變化模式；構(gòu)建正、反義表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，分析了SBPase對番茄生長發(fā)育及光合作用的影響及其影響機理。研究結(jié)果如下：
　　 1.利用同源序列設(shè)計簡并引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到SBPase基因的中間片段，通過5'-RACE和3'-RACE分別克隆到5'和3'片段，拼接后設(shè)計特異引物擴增到全長cDNA，命名為LeSBP（F

3、J959073）。該基因全長為1564 bp，ORF為1185 bp，編碼394個氨基酸，分子量約為42.5 kDa。
　　 2.同源序列比較發(fā)現(xiàn)，番茄的SBPase氨基酸序列與黃瓜、桑樹、擬南芥、菠菜、小麥、水稻和衣藻的同源性分別為83.80 ％、85.03 ％、80.05 ％、80.71 ％、76.65 ％、78.45 ％和61.31 ％。在SBPase 氨基酸序列中，有6個Cys（cysteine）是保守的，其中的2個Cy

4、s形成的CGGT(A/Q)C結(jié)構(gòu)，是參與光調(diào)節(jié)反應(yīng)的氧化還原活性位點。
　　 3.構(gòu)建了原核表達載體pET-LeSBP，并在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中誘導(dǎo)表達。以誘導(dǎo)蛋白免疫小白鼠，制備抗血清。測得效價為1:500，可以用于番茄中SBPase蛋白的免疫分析。
　　 4.Real-time PCR和Western雜交結(jié)果顯示，SBPase在番茄葉、莖和綠色果實中均有表達，以葉片中表達量最高，明顯高于其他組織，在

5、不含葉綠體的根中沒有檢測到該基因的存在；在不同葉位葉片中以中部功能葉（第8片展開葉）表達量最高，上位葉和下位葉表達量較低；第8片展開葉的Pn明顯高于第1,4，12和16片展開葉，不同葉位葉片的Pn與SBPase基因表達量及活性的變化趨勢一致；番茄功能葉片（第8片展開葉）的Pn和SBPase活性及其mRNA相對表達量呈現(xiàn)相同的日變化趨勢，說明SBPase對番茄的光合作用具有重要的調(diào)控作用。
　　 5.將獲得的LeSBP與含有35S

6、啟動子的pBI121載體重組，分別構(gòu)建了正義和反義表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄，用Real-time PCR和Western雜交方法對具有卡那抗性的轉(zhuǎn)基因番茄植株檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)正義基因植株中LeSBP在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平過量表達，反義植株中基因發(fā)生沉默。
　　 6.LeSBP過量表達時，轉(zhuǎn)正義番茄植株的SBPase活性與Pn明顯提高，碳水化合物積累量增多，莖加粗，葉面積變大，干物重量及根/冠比增加，初花期比野生型

7、提早5～7 d；反義抑制LeSBP表達時，SBPase活性下降，Pn降低，莖變細，葉面積變小，生長緩慢，初花期延遲2～5 d。
　　 7.低溫脅迫2 h，番茄葉片的LeSBP表達量及SBPase活性顯著降低，Pn明顯減小，F(xiàn)v/Fm和фPSII變化不大。轉(zhuǎn)正義番茄植株的Pn下降幅度和電解質(zhì)滲漏率增加幅度明顯小于野生型，F(xiàn)v/Fm和фPSII與野生型差異不顯著；而反義介導(dǎo)的LeSBP的缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)反義番茄植株的Pn下降幅度和電解質(zhì)滲