表達(dá)融合蛋白APB-DOCK8轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗免疫SD大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在獲得質(zhì)粒pET30a-PAcA以及外源基因APB-DOCK8轉(zhuǎn)基因番茄T0代種子的基礎(chǔ)上，制備相應(yīng)的蛋白抗原多克隆抗體，應(yīng)用PCR、Western、ELISA等技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)和植株進(jìn)行鑒定，對(duì)其融合蛋白含量、表達(dá)融合蛋白轉(zhuǎn)基因番茄口服免疫動(dòng)物誘導(dǎo)的特異性抗體和防齲效果進(jìn)行檢測(cè)。
　　方法：本研究包括三個(gè)部分
　　第一部分：重組質(zhì)粒pET30a-PAcA原核表達(dá)、蛋白純化以及抗體制備
　　1、獲得含有重組質(zhì)

2、粒pET30a-PAcA的轉(zhuǎn)化子（E. coliBL21(DE3)），并加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
　　2、裂解誘導(dǎo)后的菌體，過(guò)Ni-NTA純化柱，純化鑒定誘導(dǎo)的蛋白。
　　3、PAcA蛋白免疫新西蘭大白兔，取血，分離血清，獲得目的蛋白的多克隆抗體。第二部分：APB-DOCK8轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的基因鑒定和融合蛋白的檢測(cè)
　　1、本實(shí)驗(yàn)對(duì)如何獲得高濃度的番茄果實(shí)DNA進(jìn)行了探索，比較了改良CTAB法和植物DNA提取試劑盒法

3、兩種方法的效果，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行GUS檢測(cè)，篩選含有外源基因APB-DOCK8的植株。
　　2、采用BCA法對(duì)提取的轉(zhuǎn)基因T0、T1代番茄果實(shí)的總蛋白進(jìn)行定量；ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因T0、T1代番茄果實(shí)中融合蛋白濃度；Western blot分析融合蛋白的表達(dá)情況。與前期課題組構(gòu)建的未加入番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8轉(zhuǎn)基因番茄的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，重點(diǎn)觀察融合蛋白的表達(dá)變化。
　　第三部分：表達(dá)融合蛋白APB-DOCK8轉(zhuǎn)基因番茄

4、口服免疫SD大鼠的實(shí)驗(yàn)研究
　　1、動(dòng)物選擇及分組：24只18 d齡SD大鼠，雌性，按隨機(jī)分組原則分為：陽(yáng)性對(duì)照組8只，實(shí)驗(yàn)組8只和陰性對(duì)照組8只，建立齲齒模型。
　　2、免疫方式、抗原及劑量：實(shí)驗(yàn)組以10 mL/kg劑量喂食含融合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁（含融合蛋白365.52μg）進(jìn)行免疫，陰性對(duì)照組按10 mL/kg劑量喂食正常組非轉(zhuǎn)基因番茄果汁，而陽(yáng)性對(duì)照組喂食S. mutans UA159滅活全菌疫苗（每次1 mL，菌液

5、濃度為1×109 CFU/mL）。
　　3、免疫時(shí)間：從24 d開(kāi)始，SD大鼠每周免疫一次，連續(xù)4周。
　　4、樣品采集：第一次免疫前1 d及每次免疫7 d（直至12 w）后采集唾液、血液樣本，其中9 w、11 w不采集。
　　5、特異性抗體的檢測(cè)：用間接ELISA法檢測(cè)唾液中SIgA和血清中IgG的水平。
　　6、處死SD大鼠后取重要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查；取上下頜骨，根據(jù)Keyes經(jīng)典評(píng)分方法進(jìn)行齲齒計(jì)分。

6、>　　結(jié)果：
　　1、優(yōu)化原核表達(dá)蛋白的條件，得到純化的可溶性BL21/pET30a-PAcA蛋白，測(cè)定出該蛋白的濃度為0.5616 mg/mL，并制備出該蛋白的多克隆抗體。
　　2、提取轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)DNA時(shí)，改良CTAB法比試劑盒法更為適用。GUS方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄，顯示20株轉(zhuǎn)基因番茄植株中有15株出現(xiàn)特異性條帶，占總植株的75％。
　　3、轉(zhuǎn)基因T0、T1代番茄果實(shí)總蛋白濃度分別為13.57 mg/mL、13.

7、43 mg/mL；ELISA法檢測(cè)T0、T1轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的融合蛋白濃度分別為41.372μg/mL、36.552μg/mL。其外源融合蛋白所占的比例分別為0.3048%、0.2722%。同時(shí)Western印跡顯示轉(zhuǎn)基因番茄蛋白提取樣本出現(xiàn)了85 KD大小的特異性條帶，其大小正好符合APB融合蛋白預(yù)計(jì)大小。
　　4、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組免疫后7 d檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：動(dòng)物血清中IgG和唾液SIgA抗體水平呈逐漸升高趨勢(shì)；抗體在第6w升至最高峰

8、，第7-8w較為平穩(wěn)，第8w抗體水平開(kāi)始明顯降低。在0-12 w實(shí)驗(yàn)組特異性SIgA抗體和陽(yáng)性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組特異性IgG除在10 w與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其他時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在1-10 w陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各特異性抗體水平與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組齲損比較，除Ds級(jí)外其余各級(jí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的齲齒計(jì)分與陰性對(duì)照組

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　5、一般安全性檢測(cè)：相同時(shí)間點(diǎn)各組SD大鼠的體重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組主要臟器未見(jiàn)明顯的病理學(xué)改變。
　　結(jié)論：
　　1、重組質(zhì)粒pET30a-PAcA能成功表達(dá)出可溶性的BL21/pET30a-PAcA蛋白。成功制備了抗PAcA多克隆抗體，為下一步的轉(zhuǎn)基因番茄目的蛋白檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2、T1代轉(zhuǎn)基因番茄植株中篩選出含有外