pCAMBIA-E8-APB-DOCK8融合基因表達(dá)質(zhì)粒中標(biāo)記基因的去除及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化番茄的研究.pdf

1、齲?。╠ental caries），俗稱蟲(chóng)牙或蛀牙。它是牙體硬組織發(fā)生的慢性、進(jìn)行性破壞的疾病。其具有發(fā)病率高、分布廣等特點(diǎn)，目前已嚴(yán)重影響到了人們的生活質(zhì)量。因此，需要尋找一種能有效降低患齲率的方法已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是人類最主要的致齲菌，其中主要的致齲毒力因子是表面蛋白（surface protein antigen，PAc）和葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosylt

2、ransferases， GTFs），研究表明針對(duì)這兩種致齲毒力因子的抗體，可以有效抑制齲病的發(fā)生和發(fā)展。因此，“免疫防齲”可成為當(dāng)今有效控制齲病的方法。本課題組針對(duì)這兩種毒力因子，成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA-E8-APB-DOCK8（簡(jiǎn)稱pE8AD3），并轉(zhuǎn)化番茄獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。轉(zhuǎn)基因植物的食用安全和生態(tài)安全受到了人們的廣泛關(guān)注，目前轉(zhuǎn)基因植物的首要安全問(wèn)題來(lái)源于標(biāo)記基因的存留，將標(biāo)記基因去除可消除人們對(duì)安全性的顧慮。本

3、實(shí)驗(yàn)作為課題組實(shí)驗(yàn)的延續(xù)，將融合基因表達(dá)質(zhì)粒pE8AD3中的標(biāo)記基因Km和GUS去除，并進(jìn)一步探索番茄瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)系統(tǒng)，為后續(xù)蛋白水平的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的：以課題組構(gòu)建的質(zhì)粒pE8AD3為基礎(chǔ)，將選擇標(biāo)記基因Km和GUS去除，為后期番茄再生轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提高轉(zhuǎn)基因植物的安全性。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的注射法，建立番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，分析外源基因的表達(dá)情況。
　　方法：
　　1、運(yùn)用DNA重組技術(shù)，將pE8AD3

4、中的選擇性標(biāo)記基因Km和GUS去除。
　　2、通過(guò)對(duì)番茄無(wú)菌苗的培育，觀察不同番茄品種的出芽數(shù)、成苗數(shù)及農(nóng)藝學(xué)性狀的差異顯著性，篩選出適用于本實(shí)驗(yàn)的番茄品種；將重組質(zhì)粒 pE8AD3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，通過(guò)對(duì)番茄子葉、注射農(nóng)桿菌濃度、農(nóng)桿菌注射量、生長(zhǎng)苗齡以及共培養(yǎng)天數(shù)進(jìn)行篩選，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，觀察DOCK8基因的表達(dá)情況。
　　3、番茄再生轉(zhuǎn)化中，通過(guò)對(duì)番茄子葉外植體的培育，侵染農(nóng)桿菌后的抑菌實(shí)驗(yàn)

5、，觀察羧芐青霉素、頭孢霉素、特美汀3種抗生素在不同抑菌濃度下的抑菌效果及外植體形態(tài)的變化，確立抑菌抗生素及濃度；運(yùn)用 PCR檢測(cè)方法，對(duì)課題組獲得的轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)進(jìn)行初步篩選。
　　結(jié)果：
　　1、成功獲得不含標(biāo)記基因Km和GUS的重組質(zhì)粒pE8AD3。
　　2、建立番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，適合本實(shí)驗(yàn)的番茄品種為歐洲大紅（蘋(píng)果型），選材部位為番茄的子葉，注射農(nóng)桿菌濃度為OD600為0.2-0.7，農(nóng)桿菌注射量為50μL，

6、苗齡為7-10 d，共培養(yǎng)24-48 h。
　　3、番茄再生轉(zhuǎn)化中，特美汀作為一種有效抑制農(nóng)桿菌的抗生素，抑菌效果顯著，對(duì)植物影響小，特別適用于較難轉(zhuǎn)化的材料的轉(zhuǎn)基因過(guò)程，抑菌濃度為400 mg/L為宜，抑菌濃度過(guò)大或過(guò)小均會(huì)影響外植體的生長(zhǎng)；PCR篩選出陽(yáng)性番茄果實(shí)并保種。
　　結(jié)論：
　　1、獲得了可用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的不含Km和GUS選擇標(biāo)記基因的融合基因表達(dá)載體pE8AD3，該載體含有果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8，APB

7、中包含cat、PacA和ctxB基因，以及胞質(zhì)分裂專一蛋白8（DOCK8）。
　　2、建立并優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的試劑和儀器，在短時(shí)間內(nèi)可分離蛋白，為進(jìn)一步探索目的蛋白的生物學(xué)功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為后期外源基因蛋白表達(dá)分析的研究提供一種方便、快捷和有效的方法。
　　3、優(yōu)化出濃度為400 mg/L的特美汀抗生素作為番茄（歐洲大紅）轉(zhuǎn)基因選擇壓，該抗生素與其他抗生素相比，其優(yōu)點(diǎn)