HPV11-E6-E7與人IFNα-2b融合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與實(shí)驗(yàn)免疫研究.pdf

1、人類乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)可在人類引起多種良惡性疾患，根據(jù)其是否誘發(fā)惡性增生性病變分為低危型和高危型。HPV6、11為低危型，為引起尖銳濕疣(condylomaaccuminatum，CA)的主要HPV型別。CA在全世界發(fā)病率逐年增高，成為性傳播疾病(STD)中的最常見疾病之一。在我國(guó)，CA發(fā)病人數(shù)居STD的第二位，在歐美，則已躍居第一位，嚴(yán)重威脅著人們的身心健康。CA目前尚沒有特效治療方法，多以去

2、除疣體為主，但治療后復(fù)發(fā)率高達(dá)90﹪以上，這已成為臨床治療中棘手的問題。 由于目前的常規(guī)手段均不能徹底治愈CA，人們開始將目光集中在HPV疫苗的研制上。然而迄今為止，HPV尚無動(dòng)物模型，無法進(jìn)行體外病毒培養(yǎng)，因此按常規(guī)方法研制HPV疫苗非常困難。隨著分子生物學(xué)及基因工程的發(fā)展，人們開始運(yùn)用基因克隆的方法研制DNA疫苗、蛋白疫苗和DC(dendriticcell，樹突狀細(xì)胞)疫苗等，其中DNA疫苗由于具有以下優(yōu)點(diǎn)而受到人們的青睞：

3、(1)DNA疫苗免疫應(yīng)答持久、免疫效果可靠；(2)DNA疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫；(3)DNA疫苗安全可靠，DNA疫苗的載體部分無免疫原性，可重復(fù)接種，不會(huì)像重組疫苗一樣產(chǎn)生針對(duì)載體的自身免疫反應(yīng)；(4)DNA疫苗制備簡(jiǎn)單，容易大量生產(chǎn)，有利于控制和保證質(zhì)量，成本低；(5)DNA疫苗性質(zhì)穩(wěn)定，便于保存和運(yùn)輸。 由于DNA疫苗具有其它疫苗無可比擬的諸多優(yōu)點(diǎn)，人們開始探索用HPVDNA疫苗預(yù)防和治療HPV相關(guān)性疾病的可能。部

4、分型別的HPV疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但多集中于高危型，針對(duì)引起CA的主要型別HPV6、HPV11則較少。目前HPV疫苗的研制主要集中在L區(qū)和E6、E7區(qū)。HPV衣殼蛋白主要由L1和L2組成。L1序列保守，為HPV主要種特異性抗原，可誘生中和性抗體，主要用于制備預(yù)防性疫苗。因此，用L1抗原可制備CA的預(yù)防性疫苗及實(shí)驗(yàn)室診斷。E6、E7主要用于制備治療性疫苗，研究表明E6、E7蛋白能夠激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)和T輔助細(xì)

5、胞(Th)反應(yīng)，加之DNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)和前景，用E6、E7制備DNA疫苗具有可行性。 然而并非所有的DNA疫苗都能誘導(dǎo)出理想的和高水平的免疫反應(yīng)，這給它的臨床應(yīng)用帶來了障礙。研究表明CA患者存在著細(xì)胞因子失衡所引起的一系列細(xì)胞免疫抑制現(xiàn)象，因此改善和提高HPV感染者的細(xì)胞免疫功能成為HPV疫苗尤其是HPVDNA疫苗研究的目標(biāo)之一。有研究表明細(xì)胞因子基因與目的基因共表達(dá)或共接種可以提高目的基因編碼抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，鑒于此，我們選擇

6、人IFNα-2b與HPV11-E6/E7的編碼基因構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒探討人IFNα-2b在改善和提高HPVDNA疫苗方面的作用。IFNα具有以下作用：(1)IFNα在Th1的分化中起著重要的作用；(2)IFNα具有促進(jìn)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增殖的作用，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生IFN和IL-1；(3)IFNα可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟并增強(qiáng)其活性；(4)IFNα亦可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化，免疫球蛋白的分泌以及Ig重鏈的轉(zhuǎn)化。總之，鑒于CA的高發(fā)病率和高復(fù)發(fā)率，且

7、目前尚沒有特效治療方法，以及HPVDNA疫苗在治療CA中的前景和IFNα-2b在免疫反應(yīng)中的作用，本研究選擇引起CA的主要型別HPV11-E6/E7作為研究對(duì)象，利用IFNα-2b作為細(xì)胞因子基因與目的基因共表達(dá)或共接種可以提高目的基因編碼抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)這一構(gòu)思，首次通過連接肽基因?qū)PV¨-E6/E7與IFNα-2b連接后構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒(到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚無研究用IFNα-2b與HPV的其它型別構(gòu)建共表達(dá)質(zhì)粒)，在原核及真核細(xì)胞

8、中表達(dá)，并進(jìn)行動(dòng)物免疫接種實(shí)驗(yàn)，以探討IFNα-2b在改善和提高HPV11DNA疫苗免疫效果方面的作用。 研究目的第一部分構(gòu)建HPV11-E6/E7與人IFNα-2b融合基因表達(dá)載體，并在E.coliBL21進(jìn)行原核表達(dá)。第二部分構(gòu)建HPV11-E7及人IFNα-2b的真核表達(dá)載體，并在CHO細(xì)胞中進(jìn)行真核表達(dá)。第三部分將pcDNA3.1(+)-HPV11-E7、pcDNA3.1(+)-IFNα-2b-linker-HPV11-

9、E7作為免疫原免疫小鼠，觀察小鼠的免疫功能狀態(tài)和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 研究方法第一部分：通過連接肽基因?qū)PV11-E6/E7與人IFNα-2b編碼基因連接并克隆入原核表達(dá)載體pET-32a，進(jìn)行酶切鑒定及DNA序列分析；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coliBL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和WesternBlotting分析。第二部分：同時(shí)用KpnⅠ、EcoRⅠ酶切pET-32a-IFNα-2b-linker-HPV1

10、1-E7及pcDNA3.1(+)，將酶切產(chǎn)物純化回收，兩者的回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建pcDNA3.1(+)-IFNα-2b-linker-HPV11-E7，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒酶切鑒定；用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用免疫熒光法檢測(cè)融合基因的表達(dá)。第三部分：構(gòu)建pcDNA3.1(+)-HPV11-E7；將28只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組7只，即PBS組(A組)、空載質(zhì)粒組即pcDNA3.1組

11、(B組)、pcDNA3.1(+)-HPV11-E7組(C組)、融合基因組即pcDNA3.1(+)-IFNα-2b-linker-HPV11-E7組(D組)。初次免疫后兩周以同樣方法和相同劑量加強(qiáng)免疫，二次免疫后再以同樣方法和相同劑量加強(qiáng)免疫。于六周后剖殺BALB/c小鼠，取脾并分離脾淋巴細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并刺激單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，用FCM檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞因子比例。 研究結(jié)果第一部分：測(cè)序結(jié)果表明成功地將HPV11-E6

12、、E7和人IFNα-2b通過連接肽基因連接并克隆入pET-32a，且其基因序列與設(shè)計(jì)完全一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示HPV11-E6與人IFNα-2b融合基因未見表達(dá)，SDS-PAGE和WesternBlotting分析結(jié)果均顯示HPV11-E7與人IFNα-2b融合基因成功表達(dá)，在分子量約50KD位置可見明顯蛋白條帶。第二部分：DNA測(cè)序結(jié)果顯示，成功將IFNα-2b-linker-HPV11-E7克隆入pcDNA3.1(+)的Kp

13、nⅠ、EcoRⅠ位點(diǎn)之間，且其序列與設(shè)計(jì)完全一致；免疫熒光顯微鏡觀察可見目的蛋白的表達(dá)。第三部分：融合基因組即pcDNA3.1(+)-IFNα-2b-HPV11-E7組的IFN-γ水平明顯高于pcDNA3.1(+)-HPV11-E7組，差異具有顯著性(p＜0.001)；融合基因組與pcDNA3.1(+)-HPV11-E7組的IFN-γ水平明顯高于對(duì)照組PBS組及空載質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組，差異具有顯著性(p＜0.001)；兩對(duì)照組

14、之間的IFN-γ水平無明顯差異(p＞0.05)。4組之間的IL-4及IL-10水平無明顯差異(p＞0.05)。 結(jié)論第一部分：HPV11-E7與人IFNα-2b融合基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建及表達(dá)，為今后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)免疫研究奠定了基礎(chǔ)。第二部分：成功地構(gòu)建了HPV11-E7及IFNα-2b的真核表達(dá)載體，并在CHO細(xì)胞中表達(dá)，為提高DNA疫苗免疫效果的研究奠定了基礎(chǔ)。第三部分：作為細(xì)胞因子，IFNα-2b能明顯加強(qiáng)HPV11-E7的免