HPV11型L2E7融合蛋白的原核表達(dá)及其免疫效果觀察.pdf

1、本文根據(jù)各種流行病學(xué)資料，肛門生殖器疣(GW)是世界上一個(gè)不容忽視的公眾健康問題，每年用于GW的診斷治療費(fèi)用給人們帶來了不小的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的治療方法存在一定的缺陷，而且復(fù)發(fā)率高，于是人們?cè)趯ふ腋行У闹委熁蜉o助治療方法。 GW與人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)6型和11型的密切關(guān)系10年前就已經(jīng)明確。GW病灶會(huì)由一個(gè)逐漸擴(kuò)增成多個(gè)，常常是舊的和新的疣體并存?？梢越忉尀楫?dāng)上皮細(xì)胞局部受損傷的時(shí)候，

2、上皮細(xì)胞的完整性遭到破壞，舊病灶脫落釋放的HPV通過表皮的微小創(chuàng)傷進(jìn)入組織，感染新的上皮基底層細(xì)胞。所以被HPV感染的細(xì)胞受感染的程度不一：處于非整合狀態(tài)的部位，HPV的早晚期基因E6、E7、L1、L2都有表達(dá)；與宿主細(xì)胞DNA整合的僅能檢測(cè)到E6、E7的表達(dá)；對(duì)于這種紛亂混雜的感染狀態(tài)，就應(yīng)該既要預(yù)防HPV的擴(kuò)散感染，又要清除已被感染的細(xì)胞和相關(guān)病灶。 鑒于上述原因，人們一直在研制HPV疫苗，通過預(yù)防和治療HPV感染的策略，達(dá)

3、到預(yù)防和治療GW的目的。預(yù)防性疫苗免疫策略主要集中在如何誘發(fā)出針對(duì)HPV相關(guān)表位的高滴度中和抗體來預(yù)防感染。以HPV衣殼蛋白L1，L2為靶抗原制備的病毒樣顆粒(VLP)是預(yù)防性疫苗的主流，目前Merk公司的16、18、6、11型四價(jià)VLP疫苗已經(jīng)上市。治療性疫苗的關(guān)鍵是誘發(fā)針對(duì)病毒蛋白的細(xì)胞免疫，清除病灶和感染細(xì)胞，由于HPV-6,11型的兩個(gè)早期蛋白E6，E7在疣體中持續(xù)表達(dá)，并且與疣復(fù)發(fā)密切相關(guān)，它們是治療性疫苗理想的靶抗原。由英國(guó)

4、和比利時(shí)分別研制的HPV6b L2E7融合蛋白疫苗都已經(jīng)進(jìn)行了Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)。 本研究在實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的HPV6bL2E7、HPVl6L2E7治療性疫苗基礎(chǔ)上，構(gòu)建HPV11L2E7融合蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)，得到純化的L2E7蛋白，并在小鼠HPVll型L2E7融合蛋白的原核表達(dá)及其免疫效果觀察體內(nèi)評(píng)價(jià)其免疫原性。首先我們從尖銳濕疣組織經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得人乳頭瘤病毒11型L2、E7編碼區(qū)基因，其序列與發(fā)表的序列比對(duì)(序列號(hào)M14119)，L

5、2有兩處突變，因未引起氨基酸的改變，為同義突變；E7有一處堿基由“G”變?yōu)椤癟”，相應(yīng)位置的氨基酸由“A”變?yōu)椤癝”。構(gòu)建pMDl8T HPVllL2E7質(zhì)粒，測(cè)序證實(shí)獲得了L2E7融合基因。將融合的L2E7基因連接至缺失His的原核表達(dá)載體pET9a，構(gòu)建pET9a HPVllL2E7原核表達(dá)重組質(zhì)粒。在大腸桿菌宿主菌BL21(DE3+)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)高效表達(dá)了L2E7融合蛋白(553個(gè)氨基酸)，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Wester

6、n Blotting鑒定，表明成功表達(dá)了L2E7蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)L2E7蛋白，收獲、洗滌包涵體溶解于8M尿素(PH 8.3)進(jìn)行CM離子交換介質(zhì)純化，純化的蛋白通過Gel-Pro 3.1軟件分析其純度為83.8％。純化的L2E7蛋白與佐劑CpG-ODN和氫氧化鋁免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，進(jìn)行細(xì)胞、體液免疫指標(biāo)的檢測(cè)。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(Enzyme linkedimmunospot，ELISPOT)顯示，經(jīng)該蛋白兩次免疫后，小鼠脾單

7、個(gè)核細(xì)胞(SMNC)體外HPVllE7肽庫(kù)特異性IFN-γ分泌的斑點(diǎn)數(shù)為42.5±6.473/8 x10<'5>脾細(xì)胞，與對(duì)照組(1.8±0.7528/8 × 10<'5>脾細(xì)胞)相比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Q=16.3600，P<0.01)。細(xì)胞因子染色表明，實(shí)驗(yàn)組CD4/IFN-γ雙陽(yáng)性的細(xì)胞比例為1.8±0.1％，CD8/IFN-γ雙陽(yáng)性的細(xì)胞比例為0.3±0.1％，都高于對(duì)照組。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血清中L2和