HPV58mE6E7融合基因疫苗構(gòu)建及其免疫效果的研究.pdf

1、子宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第二位。據(jù)世界范圍內(nèi)統(tǒng)計，每年大約有50萬左右的宮頸癌新發(fā)病例，其中80％的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。我國每年有新發(fā)病例約13.15萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28.8％。近10余年來以大規(guī)模人群為基礎(chǔ)的流行病學資料顯示:在99％以上的宮頸癌中存在HPV DNA，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的首要因素且為始動因素。由于幾乎所有宮頸癌細胞中都有HPV DNA和病毒轉(zhuǎn)化蛋白的表達，HPV病毒

2、蛋白可作為一種抗原刺激機體產(chǎn)生針對HPV的免疫反應(yīng)，這就促使人們希望通過疫苗的方法來治療和預防宮頸癌。由于各型HPV之間沒有交叉保護作用而HPV基因型的分布又存在地域差異，并且目前尚無關(guān)于廣西地區(qū)宮頸癌HPV感染分子流行病學的詳細報道。為使本地區(qū)疫苗研制更具有針對性，我們對廣西地區(qū)HPV感染情況、基因型分布以及感染率高的HPV基因型病毒負載量進行了調(diào)查，擬提供一份比較可信的的資料，為廣西HPV疫苗研制提供有力的依據(jù)。
　　我們采用

3、以PCR測序為基礎(chǔ)的方法檢測了135例宮頸癌確診病人的宮頸組織DNA。結(jié)果顯示:133例宮頸癌病人感染了HPV，感染率98.52％。感染HPV16、18、31、33、35、45、52、58、59型的患者分別為125、76、17、0、0、1、2、63、5例，感染率分別為:93.98％、57.14％、12.78％、0、0、0.75％、1.50％、47.37％、3.76％，其中感染率排在前三位的是16、18和58型。通過real-time Q

4、-PCR對HPV16、18和58型進行定量檢測，三者的病毒負載量均值分別為7.89×109、9.55×103和2.38×10。HPV16型的病毒負載量明顯高于18和58型(P值＜0.05），而HPV18型的病毒負載量與58型比較無顯著差異(P值＞0.05）。
　　由于HPV58型在廣西的感染率非常高，因此，研制HPV58型疫苗非常必要。HPV58 E6和E7基因作為癌轉(zhuǎn)化蛋白，能在HPV58(+)腫瘤中將病毒DNA整合到細胞染色體

5、中并持續(xù)表達E6、E7蛋白，使宿主細胞向惡性方向轉(zhuǎn)化。盡管如此，E6和E7蛋白作為持續(xù)存在病毒抗原，卻能刺激機體產(chǎn)生較強的以病毒抗原為靶分子的特異性CTL。因此，E6、E7作為一種較理想的腫瘤相關(guān)抗原，適用于免疫治療和預防與HPV58感染導致的宮頸癌的免疫治療，但前提是必須消除E6、E7基因的轉(zhuǎn)化活性以保證疫苗的安全性。因此，我們在構(gòu)建疫苗之前，對E6和E7基因的6個轉(zhuǎn)化活性位點進行了點突變，以消除轉(zhuǎn)化活性而保留免疫原性。在證實已消除了

6、HPV58mE6E7(突變后)融合基因轉(zhuǎn)化活性的基礎(chǔ)上，將其與人IgG Fc段融合在一起形成HPV58mE6E7-Fc，在其前端加上信號肽，后端加上膜錨定蛋白GPI，使上述腫瘤抗原能夠錨定在細胞膜上表達。最后將sig-HPV58mE6E7Fc-GPI片段插入我室前期構(gòu)建的能夠融合表達GM-CSF和B7.1蛋白的真核表達載體PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游，構(gòu)建了PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗。使該疫苗在表達上

7、游融合抗原的同時，又能表達下游的GM-CSF和B7.1分子，以此來增進疫苗的協(xié)同免疫作用。隨后，我們又構(gòu)建了穩(wěn)定表達HPV58E6E7融合基因的小鼠黑色素瘤B16-HPV58E6E7細胞系，原核表達并純化了HPV58E6E7-GST融合蛋白抗原，為后續(xù)動物實驗奠定基礎(chǔ)。
　　動物實驗中，我們采用肌肉注射加在體局部電脈沖的方法，將前期構(gòu)建的PVAX1-HPV58mE6E7FcGB融合基因疫苗免疫C57BL/6小鼠。結(jié)果表明，經(jīng)疫苗免

8、疫后的小鼠，對HPV58E6E7(+)腫瘤的攻擊具有免疫保護作用。在抗腫瘤移植保護實驗中，疫苗組小鼠皮下接種的成瘤潛伏期時間長于對照組（P＜0.05）。在腫瘤生長抑制實驗中，疫苗組小鼠腫瘤生長速度較對照組明顯減慢，最終使小鼠生存期延長，平均瘤重低于對照組（P＜0.05）。研究結(jié)果還證實經(jīng)疫苗免疫的小鼠，可誘發(fā)血清特異性抗體，抗體滴度最高可達1:25600，與對照組比較，差異有顯著性（P＜0.05）。ELISPOT可以檢測到重組抗原HPV

9、58E6E7-GST蛋白誘導的特異性、分泌IFN-γ的效應(yīng)T細胞，疫苗組小鼠ELISPOT的斑點數(shù)明顯多于單獨抗原組(P＜0.05)，說明HPV58mE6E7融合基因輔以人IgG Fc段、GM-CSF和B7.1等佐劑后，可明顯增強HPV58mE6E7融合基因的免疫原性，加強其細胞免疫。通過LDH法，我們還檢測到PVAX1-HPV58mE6E7FcGB疫苗殺傷B16-HPV58E6E7細胞的CTL反應(yīng)最高達45％。說明經(jīng)該疫苗免疫后的小鼠

10、能夠產(chǎn)生有效的體液免疫和細胞免疫。在一定程度上保護免疫小鼠免受B16-HPV58E6E7細胞(1～2×105)的攻擊。
　　為提高疫苗的免疫效果，我們隨后將分子佐劑更換為hIL12，構(gòu)建了PVAX1-HPV58mE6E7Fc-hIL12疫苗并實現(xiàn)了真核表達，準備進行動物實驗。
　　總之，我們在對廣西HPV感染分子流行病學調(diào)查的基礎(chǔ)上構(gòu)建并表達了的PVAX1-HPV58mE6E7FcGB融合基因疫苗，對免疫后小鼠能夠產(chǎn)生有效的