HPV16 E7c與人β防御素2融合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與免疫功能實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建能在真核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)HBD2-E7c融合基因的重組質(zhì)粒，并初步研究其在BALB/c成年雌性小鼠中的免疫功能狀態(tài)及細(xì)胞免疫應(yīng)答，為HBD2-E7c聯(lián)合基因疫苗的研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.以pcDNA3.1(+)/E7為模板，通過(guò)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增基因片段E7c，經(jīng)雙酶切后連接到pcDNA3.1(+)載體上，構(gòu)建pcDNA3.1(+)/E7c質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切與DNA序列測(cè)定進(jìn)行鑒定

2、。
　　2.委托北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建pEGFP-C1/HBD2，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　3.同時(shí)用ApaⅠ和EcoRⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)/E7c和pEGFP-C1/HBD2，將酶切產(chǎn)物純化回收，進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建pEGFP-C1/HBD2-E7c聯(lián)合質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌JM109中，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆株，用酶切鑒定和DNA序列測(cè)定方法鑒定聯(lián)合質(zhì)粒;以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將聯(lián)合質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞中，熒

3、光顯微鏡下觀察融合基因的蛋白表達(dá)表達(dá)。
　　4.將40只四周齡的雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只:PBS組（A組），pcDNA3.1(+)/E7c質(zhì)粒（B組），空質(zhì)粒pEGFP-C1(+)和pcDNA3.1(+)/E7c(C組)，融合基因組即pEGFP-C1/HBD2-E7c(D組)，分別按每次100ug/只進(jìn)行股四頭肌肌內(nèi)注射，時(shí)間間隔2周、共注射3次。
　　5.于末次免疫后1周用摘眼球采血法收集小鼠血清，剖殺

4、小鼠后取小鼠脾臟稱重，采用脾臟指數(shù)測(cè)定檢測(cè)脾臟變化，收集免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞，采用FCM方式檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量及比值;以上?？齐纳锟萍加邢薰竞铣傻腍PV16E7短肽(GlnAlaGluProAspArgAlaHisTyrAsnIleValThrPheCysCysLysCysAsp)為抗原，經(jīng)摸索優(yōu)化條件后用間接ELISA檢測(cè)小鼠E7抗體產(chǎn)生情況。分析小鼠免疫功能，評(píng)價(jià)聯(lián)合質(zhì)粒的免疫效果。
　　結(jié)果:

5、>　　1.測(cè)序及酶切結(jié)果表明成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)/E7c及pEGFP-C1/HBD2-E7c聯(lián)合質(zhì)粒，基因序列與設(shè)計(jì)序列一致、基因位點(diǎn)無(wú)突變與表達(dá)框架移位。轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后熒光顯微鏡下可見pEGFP-C1/HBD2-E7c聯(lián)合質(zhì)粒的熒光蛋白表達(dá)。
　　2.BALB/c小鼠經(jīng)基因疫苗免疫后，pEGFP-C1/HBD2-E7c、pcDNA3.1(+)/-E7c、pcDNA3.1(+)/E7c和pEGFP-C1組與PBS對(duì)照

6、組血清E7抗體間接ELISA法OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且pEGFP-C1/HBD2-E7c組抗體量較pcDNA3.1(+)/E7c升高。
　　3.脾臟指數(shù)顯示融合基因組即D組、B組、C組三組的臟器指數(shù)明顯低于PBS對(duì)照組小鼠，融合基因組即pEGFP-C1/HBD2-E7c(D組)臟器指數(shù)低于pcDNA3.1(+)/E7c質(zhì)粒（B組），提示脾臟有一定萎縮。
　　4.經(jīng)流式分析儀分析發(fā)現(xiàn)，pEGFP-C1/HBD

7、2-E7c組CD3+(Percp)/CD4+(FITC)陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)與其余三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，占脾淋巴細(xì)胞總數(shù)的42.52±4.42％，絕對(duì)計(jì)數(shù)為4190±144/10000個(gè)細(xì)胞，明顯高于其余三組(P＜0.05);且pcDNA3.1(+)/E7c（B組）、pcDNA3.1(+)/E7c和pEGFP-C1組（C組）均顯著高于PBS對(duì)照組(P＜0.05)，它們對(duì)應(yīng)的絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為3830±138，3910±138和

8、3100±133每10000個(gè)脾淋巴細(xì)胞。
　　PBS對(duì)照組CD3+(Percp)/CD4+(FITC)陽(yáng)性淋巴細(xì)胞數(shù)為3100±133/10000個(gè)細(xì)胞，與其余三組相比顯著降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中pEGFP-C1/HBD2-E7c組占淋巴群體的百分率42.52±4.42％和絕對(duì)計(jì)數(shù)/10000個(gè)細(xì)胞明顯高于pcDNA3.1(+)/E7c（B組）的39.4±3.78％和3830±138/10000以及pcDN

9、A3.1(+)/E7c聯(lián)合pEGFP-C1組（C組）的39.5±3.79％和3910±138/10000，但三者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5.pEGFP-C1/HBD2-E7c組CD3+(Percp)/CD8+(PE)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與其他三組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，占脾淋巴細(xì)胞總數(shù)的50.16±4％，絕對(duì)計(jì)數(shù)為4970±140/10000個(gè)細(xì)胞，明顯高于其余三組（P＜0.05）;且pcDNA3.1(+

10、)/E7c（B組）、pcDNA3.1(+)/E7c和pEGFP-C1組（C組）均顯著高于PBS對(duì)照組(P＜0.05)，它們對(duì)應(yīng)的絕對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為4120±127，3780±114和2300±133每10000個(gè)脾淋巴細(xì)胞。
　　6.CD4/CD8比值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，PBS組為1.35±0.46，顯著高于其余三組(P＜0.05)，且pEGFP-C1/HBD2-E7c組最低，僅為0.84±0.03，但與pcDNA3.1(+)/

11、E7c（B組）的0.95±0.04和pcDNA3.1(+)/E7c聯(lián)合pEGFP-C1組（C組）的1.01±0.08相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.pEGFP-C1/HBD2-E7c聯(lián)合質(zhì)粒構(gòu)建成功，并在MCF7細(xì)胞中成功表達(dá)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pEGFP-C1/HBD2-E7c聯(lián)合質(zhì)粒有較強(qiáng)的免疫活性。
　　2.BalB/C小鼠免疫試驗(yàn)表明，人β防御素2可明顯改善HPV16E7基因的免疫原性