hTLR9表達及其介導(dǎo)HPV11免疫識別分子機制的研究.pdf

1、尖銳濕疣是當(dāng)今流行最廣的性傳播疾病之一，發(fā)病率30.69/10萬，而且近年來還有上升的趨勢。人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)11型和6型是其主要的致病因素，占尖銳濕疣病變的95％。近年來，雖然對尖銳濕疣的發(fā)病機制和防治方法作了大量的研究，但由于對其發(fā)病機制尚不完全清楚，故還沒有取得實質(zhì)性的突破。目前尚無有效的治療方法能完全清除體內(nèi)的HPV，所以該病是反復(fù)發(fā)作，久治不愈。 機體的免疫狀態(tài)決定了HPV感

2、染的自然史和其所致相關(guān)疾病的結(jié)局。尖銳濕疣患者免疫功能紊亂，這一點已引起同行的重視?；颊邫C體不能建立有效的免疫反應(yīng)，是造成HPV持續(xù)感染的主要原因。大多數(shù)研究認(rèn)為，摘除患者尖銳濕疣疣體后聯(lián)用免疫調(diào)節(jié)劑治療，可特異性調(diào)節(jié)抗HPV免疫應(yīng)答，并明顯降低尖銳濕疣復(fù)發(fā)率。約90％感染HPV患者能自然清除該病毒，但決定HPV清除、持續(xù)存在或病損惡變的因素目前尚不明確，因而探討尖銳濕疣的免疫學(xué)發(fā)病機制有重要的理論意義和臨床意義。 Toll-L

3、ikereceptors(TLRs)是新型的模式識別受體，與微生物病原體的識別有關(guān)，在哺乳動物的天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮橋梁作用。迄今，已有11個TLRs家族成員(TLR1～11)被相繼發(fā)現(xiàn)，其中TLR9通過識別細(xì)菌、病毒基因組DNA和人工合成的CpGODNs，依次激活白介素-1/Toll樣受體相關(guān)激酶(IL-1/Toll-likereceptorassociatedkines，IRAK)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumo

4、urnecrosisfactorreceptorassociatedfactor6，TRAF6)和NF-kappaB等一系列的效應(yīng)因子，引起TNF-alpha、IL-12和IFN-alpha等Th1型細(xì)胞因子的分泌，從而在抗感染、抗腫瘤、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自身免疫性疾病的發(fā)病過程中有重要的意義。本研究采用體外定向克隆的方法，構(gòu)建了人TLR9(HumanToll-likereceptor9，hTLR9)的pCIneo-hTLR9真核表達載體，

5、并在HEK293細(xì)胞表達，以此為基礎(chǔ)，研究TLR9在HPV11致病過程中的作用，探討HPV11感染的免疫學(xué)分子機制。 本研究由三部分組成：第一部分pCIneo-hTLR9重組真核表達載體的構(gòu)建及表達。 利用定向克隆技術(shù)構(gòu)建pCIneo-hTLR9重組真核表達載體，并轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞使之有效表達。該重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建和穩(wěn)定表達為下一步的研究提供了必備的實驗材料和奠定基礎(chǔ)。 第二部分HPV11DNA中CpG基序

6、甲基化狀態(tài)的分析及鑒定 用計算機軟件Primerpremier5.0對從pBR322-HPV11重組質(zhì)粒上酶切下來的HPV11全核苷酸序列中的CpG基序進行分類、計數(shù)和定位分析，并用限制性內(nèi)切酶PCR法鑒定CpG基序的甲基化狀態(tài)，即以AccⅡ、HpaⅡ和HaeⅡ酶切位點側(cè)翼序列為引物、以HpaⅡ酶切產(chǎn)物為模板進行PCR擴增待測基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HPV11全基因序列中，共有155個CpG基序，CpG的“C”的側(cè)翼為兩個嘌呤、“G”的

7、側(cè)翼為兩個嘧啶的ODN共14個，并且含有GACGTT，GACGCC，GGCGCC，AACGCC和AGCGTT等非甲基化的CpG基序。 第三部分TLR9介導(dǎo)HPV11DNA免疫識別的分子機制 用HPV11DNA處理HEK293+細(xì)胞，共孵育20小時后取細(xì)胞上清液，雙抗體夾心ELISA法檢測上清液中TNF-alpha，IL-12和IFN-alpha的分泌情況。并用CQ干預(yù)以研究TLR9-HPV11DNA之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，用

8、免疫印跡法檢測HPV11DNA處理HEK293+后TLR9蛋白表達是否增強。結(jié)果表明，HPV11DNA能誘導(dǎo)HEK293+細(xì)胞分泌TNF-alpha，IL-12和IFN-alpha等Th1型細(xì)胞因子；HPV11DNA中非甲基化的CpG基序為TLR9識別提供了配體，而且氯喹(CQ)能抑制HPV11DNA誘導(dǎo)HEK293+細(xì)胞分泌TNF-alpha、IFN-alpha和IL-12Th1型細(xì)胞因子；HPV11DNA處理能使HEK293+細(xì)胞的