MiR-526a參與RLRs介導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答的分子機(jī)制研究.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus，EV71)包含單股正鏈RNA基因組，屬于小RNA病毒科（piconavius family）腸道病毒屬成員，其感染嬰幼兒后能引起手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)。EV71基因組長約7.5Kb(kilobase，Kb)，僅由一個開放閱讀框構(gòu)成，編碼一個多聚蛋白前體，這個多聚蛋白前體能裂解成四個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4），七個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A、2B、

2、2C和3A、3B、3C和3D）。雖然有研究表明IFN-Ⅰ(typeⅠ interferon，IFN-Ⅰ)能保護(hù)細(xì)胞抵抗EV71的感染，然而EV71并不誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的產(chǎn)生。最近研究發(fā)現(xiàn)EV71能夠通過阻斷RIG-Ⅰ、干擾素調(diào)節(jié)因子7（interferon regulated factor7，IRF7）以及Ⅰ型干擾素受體（IFN-Ⅰ receptor，IFNAR）的表達(dá)來抑制干擾素誘導(dǎo)基因(Interferon-stimulated ge

3、ne，ISG)的激活。
　　宿主通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）和病原微生物的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）的相互作用來識別病毒和入侵微生物。PRR包括了膜受體和胞質(zhì)受體。膜受體為Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，而胞質(zhì)受體包括NOD樣受體(NOD-like recepto

4、r，NLRs)以及RLR樣受體（（RIG-Ⅰ-like receptor，RLRs）。RLR樣受體包括RIG-Ⅰ(retinoid acid-inducible geneⅠ, RIG-Ⅰ)和 MDA-5(melanomadifferentiation-associated gene5，MDA-5)。RIG-Ⅰ和MDA-5都包含CARD結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domains)，結(jié)合非帽化的RNA后與同樣含有CARD

5、結(jié)構(gòu)域的線粒體抗病毒蛋白（mitochondrial antiviral signaling，MAVS）結(jié)合，導(dǎo)致MAVS和IKK激酶(IκB kinase)結(jié)合，然后以此為平臺募集下游不同的信號分子組成不同的調(diào)控復(fù)合物，最終激活核因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulated factor，IRF3)，進(jìn)而起始β-干擾素(interferon-β，IFN-

6、β)的表達(dá)及IFN介導(dǎo)的抗病毒免疫。RIG-Ⅰ信號通路受泛素化、去泛素化、磷酸化以及去磷酸化的調(diào)控。前期報道腫瘤抑制因子圓柱瘤基因(Cylindromatosis，CYLD)可以通過調(diào)控RIG-Ⅰ的泛素化參與宿主的先天性免疫應(yīng)答信號傳導(dǎo)途徑。在樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）中缺失CYLD會誘導(dǎo)持續(xù)泛素化RIG-Ⅰ，并增強(qiáng)TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase1，TBK1)和IκB激酶ε(The I

7、κB kinaseε，IKKε)的活性。除了RIG-Ⅰ，CYLD同樣能去除核因子Kappa B基本調(diào)節(jié)因子(Nuclear factor-Kappa B essential modulator,NEMO)、IKKε、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor-associated factor2，TRAF2)以及B細(xì)胞淋巴瘤蛋白3(B-cell CLL/lymphoma3，Bcl-3)的K63位泛素化來負(fù)調(diào)控NF-κB和c-J

8、un N末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路。這些發(fā)現(xiàn)確定了CYLD成為抗病毒先天性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵調(diào)控分子。
　　MicroRNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA分子，平均長度為22nt(nucleotide，nt)。miRNA通過與靶基因的3'UTR(untranslational region，UTR)結(jié)合來抑制基因表達(dá)。miRNA參與調(diào)節(jié)許多生命進(jìn)程，發(fā)揮重要的作用。近來報道了在

9、單核細(xì)胞核巨噬細(xì)胞中miRNA參與調(diào)控先天性免疫應(yīng)答，如miR-146a靶向白介素1受體相關(guān)激酶1（IL-1R associated kinase1，IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptor associated factor6，TRAF6）來負(fù)調(diào)控RIG-Ⅰ樣受體（RIG-Ⅰ-like receptor，RLR）信號通路。然而到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于EV71通過miRNA調(diào)控RIG-Ⅰ信號通路的報道。本研究發(fā)現(xiàn)

10、:
　　1.miR-526a的表達(dá)受RNA病毒誘導(dǎo)激活的IRF3/7轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控:利用熒光定量PCR(quantitative polymerase chain reactin，q-PCR)的方法，發(fā)現(xiàn)RNA病毒感染可以顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)miR-526a的表達(dá);通過RNA干涉手段，發(fā)現(xiàn)IRF3、7敲低細(xì)胞中水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)誘導(dǎo)的miR-526a上調(diào)被顯著抑制，以上結(jié)果提示

11、我們miR-526a的表達(dá)受RNA病毒誘導(dǎo)激活的IRF3/7轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。
　　2.miR-526a促進(jìn)RIG-Ⅰ信號通路的激活:通過合成miR-526a模擬物以及抑制劑，利用IFN-β、NF-κB以及IRF3報告基因活性檢測方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以顯著增強(qiáng)RIG-Ⅰ信號通路的激活，這種激活活性可以被miR-526a抑制劑阻斷;利用q-PCR以及AlphaLISA技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-526a能夠促進(jìn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β

12、的轉(zhuǎn)錄和分泌;利用q-PCR方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a的過表達(dá)能夠激活I(lǐng)FN-β的下游誘導(dǎo)基因ISG56、ISG54、白介素-8（interleukin-8，IL-8）以及趨化因子配體-2(Chemokine(C-X-C motif) ligand2，CXCL-2)的表達(dá)，以上結(jié)果顯示miR-526a是參與調(diào)控RIG-Ⅰ信號通路的正調(diào)控因子。
　　3.miR-526a抑制VSV和NDV病毒的復(fù)制:用免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)miR-526a

13、模擬物能夠抑制VSV病毒感染后VSV-G蛋白的表達(dá);以新城疫病毒NDV-GFP(Newcastle Disease Virus，NDV)病毒感染細(xì)胞為模型，利用熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)檢測方法發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以顯著抑制NDV病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，以上結(jié)果提示我們miR-526a可以抑制RNA病毒復(fù)制。
　　4.miR-526a通過靶向CYLD激活RIG-Ⅰ信號通路:通過生物信息學(xué)軟件TargetScan等預(yù)測，發(fā)現(xiàn)CYL

14、D是miR-526a潛在的靶點(diǎn)。檢測帶有不同位置的CYLD3'UTR熒光素酶報告基因的活性發(fā)現(xiàn)CYLD存在miR-526a作用位點(diǎn);利用q-PCR以及免疫印跡方法，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物能夠下調(diào)CYLD的轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白水平。利用細(xì)胞泛素化實驗，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以增強(qiáng)病毒誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ K63位泛素化水平，而miR-526a抑制劑可以抑制病毒誘導(dǎo)的RIG-Ⅰ的泛素化;利用免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)miR-526a模擬物可以增強(qiáng)

15、病毒誘導(dǎo)的IKKα/β、IκB及IRF3的磷酸化，以上實驗說明miR-526a通過靶向CYLD增強(qiáng)RIG-Ⅰ的K63位泛素化修飾，進(jìn)而激活RIG-Ⅰ信號通路。
　　5.EV71病毒利用3C蛋白酶靶向miR-526a抑制RIG-Ⅰ信號通路的激活:利用q-PCR以及免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)EV71病毒感染后下調(diào)miR-526a的表達(dá)、IRF7的激活以及IFN-β的產(chǎn)生，以上表型均由EV71的3C蛋白酶介導(dǎo);通過免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)miR-52

16、6a模擬物及CYLD的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)能夠抑制EV71病毒的復(fù)制以及EV71 VP1蛋白的表達(dá)，以上結(jié)果說明EV71通過靶向miR-526a阻斷RIG-Ⅰ信號通路的激活。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)病毒感染巨噬細(xì)胞后能顯著上調(diào)miR-526a，并依賴IRF3/7的激活。而miR-526a通過靶向CYLD，去除RIG-Ⅰ的K63位泛素化正調(diào)控VSV介導(dǎo)的IRF3和NF-κB的激活。