miR-140在先天性心臟病肺動脈高壓的作用機制.pdf

1、先天性心臟病是最常見的先天性疾病，在世界范圍內(nèi)影響1％的新生嬰兒。肺動脈高壓是先天性心臟病常見的并發(fā)癥，是引起圍手術(shù)期病人死亡的重要原因，其主要特征是肺血管阻力持續(xù)性升高。先天性心臟病肺動脈高壓的發(fā)病機制主要有肺血管重構(gòu)和動力型肺血管阻力增加等。目前針對先天性心臟病肺動脈高壓缺乏有效的治療手段，進一步研究先天性心臟病的發(fā)病和調(diào)控機制，尋找更有效更安全的治療方法，具有積極的意義。
　　miRNA與心臟發(fā)育、心臟疾病的發(fā)生等過程密切相

2、關(guān)。miRNA廣泛參與到肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和凋亡等多種生理過程，并對多種信號通路具有調(diào)節(jié)作用。本研究首先檢測了先天性心臟病肺動脈高壓患者肺組織miR-140及Wnt信號通路相關(guān)蛋白表達及其與肺組織血管結(jié)構(gòu)、肺血管細(xì)胞凋亡的關(guān)系，又進一步研究了miR-140對HPASMC增殖、遷移和表型的影響，再進一步驗證miR-140與Wnt信號通路的關(guān)系，最后探索了Wnt信號通路對HPASMC增殖、遷移和表型的影響，為進一

3、步研究先天性心臟病肺動脈高壓的發(fā)病和調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。本研究共分為以下兩個部分。
　　第一部分 miR-140與先天性心臟病肺動脈高壓
　　方法：
　　1.利用qRT-PCR和western blot檢測先天性心臟病肺動脈高壓患者肺組織miR-140及Wnt信號通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin mRNA及蛋白水平的表達變化，并分析了miR-140與肺動脈壓高低的關(guān)系。對照組為無肺動脈高壓的先天性心臟病患者。

4、
　　2.利用HE染色的方法研究了先天性心臟病肺動脈高壓患者肺組織形態(tài)變化、血管結(jié)構(gòu)WT%、WA%變化，并分析了miR-140與WT%、WA%的關(guān)系。
　　3.利用TUNEL的方法檢測了先天性心臟病肺動脈高壓患者肺組織的凋亡情況并計算了凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），采用qRT-PCR和western blot的方法檢測了肺組織中凋亡相關(guān)蛋白bax，bcl-2，survivin的表達變化，并分析了miR-1

5、40表達的變化與AI，bax，bcl-2和survivin的關(guān)系
　　結(jié)果：
　　1.和無肺動脈高壓患者相比，并發(fā)肺動脈高壓患者miR-140表達下調(diào)，Wnt信號通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin表達上調(diào)，相關(guān)性分析顯示miR-140表達量與肺動脈壓、Wnt信號通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin表達均呈負(fù)相關(guān)。
　　2.無肺動脈高壓患者肺組織病變不明顯，輕度肺動脈高壓患者肺間隔輕微增厚，葉間隔增寬，肺泡

6、腔及小血管輕度充血。中重度肺動脈高壓患者肺泡明顯擴張，肺泡間隔增寬明顯，局部纖維化，血管管壁增厚，管腔狹窄。隨著肺動脈壓力的增高，患者肺組織血管管壁逐漸增厚，WT%、WA%逐漸上升。相關(guān)性分析顯示W(wǎng)T%、WA%與肺動脈壓力呈正相關(guān)，與miR-140負(fù)相關(guān)。
　　3.肺動脈高壓患者肺組織血管內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，AI下降，相關(guān)性分析顯示AI與miR-140呈正相關(guān)，與肺動脈壓力、WT%、WA%呈負(fù)相關(guān)。qRT-PCR及western

7、blot結(jié)果顯示bax在無肺動脈高壓及輕度肺動脈高壓患者肺組織中表達較多，中重度肺動脈高壓患者bax表達明顯減少，bcl-2、survivin表達則與bax相反。相關(guān)性分析顯示miR-140與bax呈正相關(guān)，與bcl-2，survivin表達呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分 miR-140在肺動脈平滑肌細(xì)胞（HPASMC）作用機制方法
　　1.將原代培養(yǎng)的HPASMCs置于低氧與常氧的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h，然后采用qR

8、T-PCR和western blot的方法分別檢測miR-140、Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白的表達情況的表達情況。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-140 mimic和inhibitor，在缺氧條件下培養(yǎng)HPASMCs，利用CCK-8法檢測miR-140對HPASMCs增殖的作用，細(xì)胞劃痕實驗檢測HPASMCs遷移能力的變化，western blot檢測與平滑肌細(xì)胞收縮表型相關(guān)的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-

9、1和SM22α蛋白表達水平的變化。
　　3.將轉(zhuǎn)染miR-140 mimic和inhibitor的HPASMCs置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用qRT-PCR和western blot方法分別檢測Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白的表達情況。
　　4.通過TargetScan，DIANA和miRanda在線工具預(yù)測Wnt-1的miR-140識別位點，利用雙熒光素酶報告分析miR-140和Wnt-13’-UTR的相互作用。

10、
　　5.通過轉(zhuǎn)染重組質(zhì)?；騭iRNA過表達或敲降Wnt-1，采用CCK-8法檢測過表達及敲降Wnt-1對HPASMCs的增殖能力的影響，細(xì)胞劃痕實驗檢測Wnt-1對HPASMCs遷移的影響，western blot檢測與平滑肌細(xì)胞收縮表型相關(guān)的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表達水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1. qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示，在缺氧條件下H

11、PASMCs中miR-140表達下調(diào)，Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白表達上調(diào)。
　　2.缺氧條件下，轉(zhuǎn)染miR-140 mimic過表達miR-140，HPASMCs的增殖速率明顯降低，遷移距離和遷移細(xì)胞數(shù)減少，平滑肌細(xì)胞收縮表型相關(guān)的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表達顯著增強；轉(zhuǎn)染miR-140 inhibitor抑制miR-140表達，細(xì)胞增殖速率升高、遷移增加，收縮表型相關(guān)蛋白

12、表達減少。
　　3.缺氧條件下，轉(zhuǎn)染miR-140 mimic過表達miR-140，Wnt-1的mRNA和蛋白的表達水平顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-140 inhibitor抑制miR-140表達，Wnt-1的mRNA和蛋白表達水平顯著升高。
　　4.通過TargetScan，DIANA和miRanda在線工具預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Wnt-1的3’-UTR有miR-140的識別位點，雙熒光素酶報告實驗結(jié)果表明miR-140和預(yù)測的Wnt-13

13、’-UTR識別位點有相互作用。這些結(jié)果充分證實了miR-140直接靶向Wnt-1。
　　5.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒過表達Wnt-1，在缺氧條件下HPASMCs增殖速率升高，遷移距離和遷移細(xì)胞數(shù)增多，SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表達降低。轉(zhuǎn)染siRNA敲降Wnt-1表達，細(xì)胞增殖速率降低、遷移減少，收縮表型相關(guān)蛋白表達增加。
　　結(jié)論：
　　1.先天性心臟病肺動脈高壓患者miR-140表

14、達下調(diào)，Wnt信號通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin表達上調(diào)，miR-140表達量與肺動脈壓、WT%、WA%呈負(fù)相關(guān)，與AI呈正相關(guān)。
　　2.在缺氧條件下HPASMCs中miR-140表達下調(diào)，Wnt-1表達上調(diào)，miR-140直接靶向Wnt-13’-UTR從而抑制Wnt-1的表達。
　　3.在缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中miR-140可以抑制HPASMCs增殖和遷移，促進平滑肌細(xì)胞收縮表型蛋白的表達。
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