miR-140在先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓的作用機(jī)制.pdf

1、先天性心臟病是最常見的先天性疾病，在世界范圍內(nèi)影響1％的新生嬰兒。肺動(dòng)脈高壓是先天性心臟病常見的并發(fā)癥，是引起圍手術(shù)期病人死亡的重要原因，其主要特征是肺血管阻力持續(xù)性升高。先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制主要有肺血管重構(gòu)和動(dòng)力型肺血管阻力增加等。目前針對(duì)先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓缺乏有效的治療手段，進(jìn)一步研究先天性心臟病的發(fā)病和調(diào)控機(jī)制，尋找更有效更安全的治療方法，具有積極的意義。
　　miRNA與心臟發(fā)育、心臟疾病的發(fā)生等過程密切相

2、關(guān)。miRNA廣泛參與到肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展的過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和凋亡等多種生理過程，并對(duì)多種信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用。本研究首先檢測(cè)了先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓患者肺組織miR-140及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及其與肺組織血管結(jié)構(gòu)、肺血管細(xì)胞凋亡的關(guān)系，又進(jìn)一步研究了miR-140對(duì)HPASMC增殖、遷移和表型的影響，再進(jìn)一步驗(yàn)證miR-140與Wnt信號(hào)通路的關(guān)系，最后探索了Wnt信號(hào)通路對(duì)HPASMC增殖、遷移和表型的影響，為進(jìn)一

3、步研究先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究共分為以下兩個(gè)部分。
　　第一部分 miR-140與先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓
　　方法：
　　1.利用qRT-PCR和western blot檢測(cè)先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓患者肺組織miR-140及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化，并分析了miR-140與肺動(dòng)脈壓高低的關(guān)系。對(duì)照組為無肺動(dòng)脈高壓的先天性心臟病患者。

4、
　　2.利用HE染色的方法研究了先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓患者肺組織形態(tài)變化、血管結(jié)構(gòu)WT%、WA%變化，并分析了miR-140與WT%、WA%的關(guān)系。
　　3.利用TUNEL的方法檢測(cè)了先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓患者肺組織的凋亡情況并計(jì)算了凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），采用qRT-PCR和western blot的方法檢測(cè)了肺組織中凋亡相關(guān)蛋白bax，bcl-2，survivin的表達(dá)變化，并分析了miR-1

5、40表達(dá)的變化與AI，bax，bcl-2和survivin的關(guān)系
　　結(jié)果：
　　1.和無肺動(dòng)脈高壓患者相比，并發(fā)肺動(dòng)脈高壓患者miR-140表達(dá)下調(diào)，Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin表達(dá)上調(diào)，相關(guān)性分析顯示miR-140表達(dá)量與肺動(dòng)脈壓、Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。
　　2.無肺動(dòng)脈高壓患者肺組織病變不明顯，輕度肺動(dòng)脈高壓患者肺間隔輕微增厚，葉間隔增寬，肺泡

6、腔及小血管輕度充血。中重度肺動(dòng)脈高壓患者肺泡明顯擴(kuò)張，肺泡間隔增寬明顯，局部纖維化，血管管壁增厚，管腔狹窄。隨著肺動(dòng)脈壓力的增高，患者肺組織血管管壁逐漸增厚，WT%、WA%逐漸上升。相關(guān)性分析顯示W(wǎng)T%、WA%與肺動(dòng)脈壓力呈正相關(guān)，與miR-140負(fù)相關(guān)。
　　3.肺動(dòng)脈高壓患者肺組織血管內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，AI下降，相關(guān)性分析顯示AI與miR-140呈正相關(guān)，與肺動(dòng)脈壓力、WT%、WA%呈負(fù)相關(guān)。qRT-PCR及western

7、blot結(jié)果顯示bax在無肺動(dòng)脈高壓及輕度肺動(dòng)脈高壓患者肺組織中表達(dá)較多，中重度肺動(dòng)脈高壓患者bax表達(dá)明顯減少，bcl-2、survivin表達(dá)則與bax相反。相關(guān)性分析顯示miR-140與bax呈正相關(guān)，與bcl-2，survivin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　第二部分 miR-140在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（HPASMC）作用機(jī)制方法
　　1.將原代培養(yǎng)的HPASMCs置于低氧與常氧的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h和48 h，然后采用qR

8、T-PCR和western blot的方法分別檢測(cè)miR-140、Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白的表達(dá)情況的表達(dá)情況。
　　2.轉(zhuǎn)染miR-140 mimic和inhibitor，在缺氧條件下培養(yǎng)HPASMCs，利用CCK-8法檢測(cè)miR-140對(duì)HPASMCs增殖的作用，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HPASMCs遷移能力的變化，western blot檢測(cè)與平滑肌細(xì)胞收縮表型相關(guān)的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-

9、1和SM22α蛋白表達(dá)水平的變化。
　　3.將轉(zhuǎn)染miR-140 mimic和inhibitor的HPASMCs置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用qRT-PCR和western blot方法分別檢測(cè)Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白的表達(dá)情況。
　　4.通過TargetScan，DIANA和miRanda在線工具預(yù)測(cè)Wnt-1的miR-140識(shí)別位點(diǎn)，利用雙熒光素酶報(bào)告分析miR-140和Wnt-13’-UTR的相互作用。

10、
　　5.通過轉(zhuǎn)染重組質(zhì)?；騭iRNA過表達(dá)或敲降Wnt-1，采用CCK-8法檢測(cè)過表達(dá)及敲降Wnt-1對(duì)HPASMCs的增殖能力的影響，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Wnt-1對(duì)HPASMCs遷移的影響，western blot檢測(cè)與平滑肌細(xì)胞收縮表型相關(guān)的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1. qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示，在缺氧條件下H

11、PASMCs中miR-140表達(dá)下調(diào)，Wnt-1 mRNA和Wnt-1蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　2.缺氧條件下，轉(zhuǎn)染miR-140 mimic過表達(dá)miR-140，HPASMCs的增殖速率明顯降低，遷移距離和遷移細(xì)胞數(shù)減少，平滑肌細(xì)胞收縮表型相關(guān)的SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染miR-140 inhibitor抑制miR-140表達(dá)，細(xì)胞增殖速率升高、遷移增加，收縮表型相關(guān)蛋白

12、表達(dá)減少。
　　3.缺氧條件下，轉(zhuǎn)染miR-140 mimic過表達(dá)miR-140，Wnt-1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-140 inhibitor抑制miR-140表達(dá)，Wnt-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　　4.通過TargetScan，DIANA和miRanda在線工具預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Wnt-1的3’-UTR有miR-140的識(shí)別位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-140和預(yù)測(cè)的Wnt-13

13、’-UTR識(shí)別位點(diǎn)有相互作用。這些結(jié)果充分證實(shí)了miR-140直接靶向Wnt-1。
　　5.轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒過表達(dá)Wnt-1，在缺氧條件下HPASMCs增殖速率升高，遷移距離和遷移細(xì)胞數(shù)增多，SM-MHC、SM-α-actin、Calponin-1和SM22α蛋白表達(dá)降低。轉(zhuǎn)染siRNA敲降Wnt-1表達(dá)，細(xì)胞增殖速率降低、遷移減少，收縮表型相關(guān)蛋白表達(dá)增加。
　　結(jié)論：
　　1.先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓患者miR-140表

14、達(dá)下調(diào)，Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt-1和β-catenin表達(dá)上調(diào)，miR-140表達(dá)量與肺動(dòng)脈壓、WT%、WA%呈負(fù)相關(guān)，與AI呈正相關(guān)。
　　2.在缺氧條件下HPASMCs中miR-140表達(dá)下調(diào)，Wnt-1表達(dá)上調(diào)，miR-140直接靶向Wnt-13’-UTR從而抑制Wnt-1的表達(dá)。
　　3.在缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中miR-140可以抑制HPASMCs增殖和遷移，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞收縮表型蛋白的表達(dá)。
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