血漿miRNA在先天性心臟病繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓的差異表達(dá)的篩選及其功能研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(PAH)是左向右分流型先天性心臟病(CHD)常見的合并癥，相對(duì)于無PAH的先天性心臟病患者，合并PAH的CHD患者在手術(shù)后并發(fā)癥較多，極易引發(fā)死亡，醫(yī)護(hù)人員對(duì)患者的監(jiān)護(hù)難度加大，但不能有效降低死亡率。繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓是先天性心臟病常見并發(fā)癥，目前，對(duì)此缺乏特異性無創(chuàng)診斷手段及藥物治療，嚴(yán)重影響了介入治療或外科手術(shù)的預(yù)后效果，也成為是患者手術(shù)后仍有很高死亡率的重要原因。
　　小RNA分子(miRNA)是一組約有21-23

2、個(gè)核苷酸的高度保守的非編碼RNA，廣泛存在于植物、微生物和哺乳動(dòng)物中，在心血管疾病和腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中，miRNA通過與靶基因的3'UTR區(qū)域部分序列相結(jié)合，互補(bǔ)后降解已轉(zhuǎn)錄的靶基因的mRNA，或者抑制靶基因編碼蛋白進(jìn)而對(duì)各種疾病起到調(diào)節(jié)作用。
　　miRNA的表達(dá)具有高度特異性，使得在疾病中可能會(huì)有相同的一種或多種miRNA表達(dá)改變。因此，在研究某一疾病的表達(dá)譜時(shí)，需要納入大量患者樣本進(jìn)行研究，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)共同的血漿miRN

3、A表達(dá)譜，同時(shí)需要經(jīng)過大規(guī)模的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，才能最終應(yīng)用于臨床實(shí)踐。
　　目的:
　　1.左向右分流先天性心臟病單純性室間隔缺損不繼發(fā)重度肺動(dòng)脈高壓患者和繼發(fā)重度肺動(dòng)脈高壓患者血漿中的miRNA差異表達(dá)譜的建立與驗(yàn)證。2.關(guān)鍵差異miRNA與合并肺動(dòng)脈高壓患者臨床資料相關(guān)性分析。3.關(guān)鍵miRNA在合并肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展中的作用與機(jī)制研究。
　　方法:
　　1.差異表達(dá)譜構(gòu)建:隨機(jī)自2010年12月至2014年

4、8月入住廣東省心血管病研究所心兒科的患者中抽選6例診斷為室間隔缺損合并重度肺動(dòng)脈高壓（VSD/PAH重度）的患者和6例不合并肺動(dòng)脈高壓的患者。其中心臟手術(shù)中麻醉狀態(tài)下測壓導(dǎo)管直接測量肺動(dòng)脈收縮壓、體循環(huán)收縮壓，選擇肺動(dòng)脈收縮壓/體循環(huán)收縮壓Pp/Ps≥0.75的患者為VSD-PAH組;選擇肺動(dòng)脈收縮壓/體循環(huán)收縮壓Pp/Ps＜0.30的患者為對(duì)照組VSD-NPAH組。收集入選病人的血樣標(biāo)本6mL于EDTA抗凝管中，離心去雜質(zhì)后使用mRN

5、A抽提試劑盒提取血漿樣本的總mRNA，經(jīng)質(zhì)檢后采用丹麥Exiqon公司的miRNA微陣列芯片miRCURYTMArray進(jìn)行雜交，用Axon GenePix4000B芯片掃描儀對(duì)圖像信號(hào)進(jìn)行掃描，使用GenePixpro V6.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
　　2.熒光定量PCR驗(yàn)證:根據(jù)miRNA芯片檢測的結(jié)果結(jié)合文獻(xiàn)資料和生物信息學(xué)分析，從差異表達(dá)的miRNA分子中選取15個(gè)差異較為明顯的miRNA分子，擴(kuò)大樣本到每組100例

6、，采用莖-環(huán)的RT-PCR方法研究方法進(jìn)行檢測，并且cel-mir-39作為實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參對(duì)PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，對(duì)差異表達(dá)譜進(jìn)行初步驗(yàn)證。各RNA數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布，故使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法Mann-Whitney U test進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)，以中位數(shù)±四分位數(shù)間距表達(dá)各組數(shù)據(jù)分布情況。
　　3.臨床資料相關(guān)性分析:巢式病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，入選單純先天性體-肺循環(huán)分流性心臟病患者及相關(guān)肺動(dòng)脈高壓患者擴(kuò)大樣本至每組100例，并詳細(xì)記錄

7、病人的年齡、體重、心臟各指標(biāo)、血壓等各臨床指標(biāo)等信息，采用Pearson相關(guān)分析經(jīng)驗(yàn)證的差異miRNAs與各臨床檢測指標(biāo)的相關(guān)性。
　　4.miRNA-16作用研究:轉(zhuǎn)染miR-16 mimics或inhibitor，細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究miR-16對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　5.miRNA-16的靶基因預(yù)測和驗(yàn)證:運(yùn)用miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫miRBase、Pictar、Targetscan檢索miR

8、NA-16的靶基因;使用熒光定量-PCR和western Blot方法檢測miR-16對(duì)關(guān)鍵靶基因的調(diào)控作用;使用熒光素酶報(bào)告載體驗(yàn)證miR-16對(duì)關(guān)鍵靶基因的直接調(diào)控作用。
　　6.miRNA-16作用機(jī)制研究:共同轉(zhuǎn)染miR-16 mimics或inhibitor以及關(guān)鍵靶基因過表達(dá)載體和關(guān)鍵靶基因siRNA，細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究miR-16發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA芯

9、片結(jié)果顯示與左向右分流先心病不合并肺動(dòng)脈高壓者血漿相比，重度肺動(dòng)脈高壓者血漿中101個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)超過3倍，54個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)超過3倍。
　　2.統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在所驗(yàn)證的差異miRNA分子中，mirK12-8、mirK12-10a、mirK12-12、mirUS25-2、mir16、mir17a、mir19a、mir20a、mir21、mir22、mir92、mir98、mir143、mir204在合并肺動(dòng)脈高壓中均表

10、達(dá)上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，與芯片結(jié)果變化趨勢一致。
　　3.Stepwise法相關(guān)性分析顯示，目標(biāo)miRNA在兩組患者中與其臨床指標(biāo)具有明顯相關(guān)性。
　　4.miR-16的生物學(xué)功能:我們首先研究了miR-16對(duì)HPASMC細(xì)胞增殖的影響。使用Invitrogen公司的siRNA轉(zhuǎn)染試劑在PAH細(xì)胞和細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染由吉瑪公司合成的miR-16 mimics和inhibitor，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，在HPASMC細(xì)

11、胞中過表達(dá)miR-16可以促進(jìn)HPASMC細(xì)胞的增殖;我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HPASMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-16之后的遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-16 mimicsNC轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，miR-16 mimics能使HPASMC細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)。與之相反的，同miR-16 inhibitor NC轉(zhuǎn)染組相比，miR-16 inhibitor能使HPASMC細(xì)胞的遷移能力減弱。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-16能夠顯著促進(jìn)HPASMC細(xì)胞

12、的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　5.miR-16的靶基因預(yù)測及驗(yàn)證:使用三個(gè)較為權(quán)威的數(shù)據(jù)庫Target Scan在線軟件、Pic Tar在線軟件和MiRanda在線軟件對(duì)的miRNA-16的靶基因進(jìn)行預(yù)測，其中有33個(gè)靶基因在三個(gè)數(shù)據(jù)庫共同被預(yù)測到。RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HPASMC中過表達(dá)miR-16后，RBM6的mRNA水平下降明顯，而轉(zhuǎn)染inhibitor組結(jié)合剛好相反。Western Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR

13、-16能夠下調(diào)細(xì)胞中RBM6的蛋白水平，抑制miR-16的表達(dá)可以上調(diào)RBM6的蛋白水平。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染miR-16 mimics有效抑制了連有RBM63'UTR區(qū)PGL4載體上的熒光素酶活性，RBM63'UTR突變區(qū)則無效果;相反的，而共同轉(zhuǎn)染miR-16 inhibitor的239T細(xì)胞中熒光素酶活性明顯增強(qiáng)，而RBM63'UTR突變區(qū)則無效果。
　　6.miR-16通過靶向在HPASMC中的作用:本課題利用細(xì)

14、胞遷移實(shí)驗(yàn)明確RBM6在miR-16促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用。在HPASMC細(xì)胞中加入miR-16的mimics后，過表達(dá)RBM6，然后檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入miR-16的mimics后，細(xì)胞劃痕間距明顯縮短，增強(qiáng)了HPASMC細(xì)胞的遷移能力。在細(xì)胞中回補(bǔ)RBM6后，可以將miR-16促進(jìn)的細(xì)胞遷移能力抑制回原來的75％作用。以上結(jié)果顯示，下調(diào)內(nèi)源性RBM6蛋白表達(dá)可以抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力。同時(shí)，可以部分恢復(fù)mi

15、R-16對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用。綜上所述，miR-16可能通過下調(diào)細(xì)胞RBM6的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1.芯片結(jié)果證實(shí)先天性心臟病合并重度肺動(dòng)脈高壓和為合并患者血漿中存在差異表達(dá)的miRNAs，提示血漿miRNAs在繼發(fā)性重度肺動(dòng)脈高壓中起一定的調(diào)控作用。
　　2.利用莖環(huán)熒光定量PCR對(duì)芯片中部分差異表達(dá)的miRNAs的表達(dá)進(jìn)行大樣本驗(yàn)證，證實(shí)芯片結(jié)果可靠。
　　3.經(jīng)生物信息學(xué)