變異鏈球菌cat-pacA-ctxB-DOCK8-DHR融合基因表達質(zhì)粒的構建.pdf

1、目的:構建含有變異鏈球菌表面蛋白A區(qū)編碼基因pacA和葡糖基轉移酶(GTF)催化區(qū)編碼基因cat,佐劑CTB的編碼基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能區(qū)DHR編碼基因的融合基因表達質(zhì)粒,利用番茄果實特異性啟動子E8啟動融合蛋白的表達,添加柔性肽基因修飾,構建穩(wěn)定高效的番茄果實特異表達質(zhì)粒,為下一步轉化番茄植株提供實驗基礎。
　　方法:實驗共分二部分:
　　第一部分變異鏈球菌cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR融

2、合基因表達質(zhì)粒的構建
　　①設計特異引物,通過PCR獲得變異鏈球菌表面蛋白PAC的編碼基因pacA、葡糖基轉移酶編碼基因 cat、無功能糖基轉移酶樣蛋白(DOCK8)的核心功能區(qū) DHR編碼基因;
　　②T-A克隆構建中間載體pMD-cat、pMD-pacA-ctxB、pMD-DOCK8/DHR質(zhì)粒;
　?、勖盖衟MD-cat、pMD-pacA-ctxB、pMD-DOCK8/DHR質(zhì)粒獲得目的基因,通過定向克隆與 pE

3、T32a(+)表達載體進行重組,獲得重組質(zhì)粒pET-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR;
　　第二部分植物表達質(zhì)粒p2301-E8-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR的構建
　　限制性內(nèi)切酶酶切 pET-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR獲得融合基因片段 cat-pacA-ct xB-DOCK8/DHR,經(jīng)定向克隆與植物轉化載體 pCAMBIA2301重組,加入從番茄基因組中所提出的番茄果

4、實特異性啟動子E8,獲得植物表達質(zhì)粒p2301-E8-cat-pacA-ct xB-DOCK8/DHR。
　　結果:
　　1)構建的表達質(zhì)粒pET-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR經(jīng)KpnI、SalI雙酶切,能得到約4.9kb大小片斷,與預計目的基因片斷大小相同,經(jīng)測序證實插入的方向正確。
　　2)重組質(zhì)粒p2301-cat-pacA-ctxB-DOCK8/DHR經(jīng)KpnI、SalI酶切得到約11.6kb