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文檔簡介
1、植物激素乙烯影響植物的生長和發(fā)育。而對于呼吸躍變型果實,乙烯對于果實的成熟、衰老作用十分重要,被稱為成熟激素。植物的乙烯反應(yīng)是通過乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實現(xiàn)的。本論文以番茄成熟突變體Green-ripe(Gr)為研究材料,探討Gr基因的功能和作用模式,進一步完善番茄的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論。本論文主要做了以下工作: (1)Gr基因的克隆及原核表達(dá):通過RT-PCR方法從綠熟期番茄果實中克隆Gr基因,PCR產(chǎn)物被亞克隆到原核表達(dá)載體pET-
2、30a上,在大腸桿菌BL21中篩選到含有目的基因的重組質(zhì)粒,并采用0.1mM/L的:IPTG誘導(dǎo)3小時表達(dá)外源蛋白。 (2)Gr蛋白純化及多克隆抗體的制備:應(yīng)用Ni-NTA親和層純化回收Gr蛋白,當(dāng)洗脫液中咪唑濃度達(dá)到40mM/L時,能夠很好的洗脫外源蛋白,表達(dá)蛋白純度可以達(dá)到96%。采用純化的蛋白免疫兔子制備抗Gr蛋白的多克隆抗體,經(jīng)檢測多克隆抗體的效價大于10000,經(jīng)過DEAE-52離子交換柱純化抗體,可以得到純度較高的抗
3、體。Western blotting檢測表明,抗Gr蛋白的多克隆抗體具有免疫特異性。 (3)Gr基因表達(dá)模式的研究及細(xì)胞定位研究:研究Gr基因在番茄各組織器官中的表達(dá)模式,并研究外源乙烯處理對Gr基因表達(dá)的影響。在RNA水平上,采用RT-PCR的方法,證明Gr基因的表達(dá)具有組織特異性,在種子、花及綠熟期番茄果實中表達(dá)量明顯高于其他部分。而外源乙烯能夠明顯引起花和綠熟期番茄果實中Gr基因的表達(dá),說明這種乙烯誘導(dǎo)的Gr基因表達(dá)量的降
4、低同樣具有組織特異性。在蛋白水平上,采用Western blotting的方法,利用制備的Gr蛋白的多克隆抗體檢測Gr蛋白的表達(dá)情況。研究表明Gr在蛋白水平的表達(dá)情況與在RNA水平的表達(dá)情況基本一致。 (4)酵母雙雜交法研究Gr蛋白與乙烯受體蛋白之間的作用模式:通過采用酵母雙雜交的方法,將Gr基因與乙烯受體基因片段分別構(gòu)建雙雜交載體pGAD-T7及pGBK-T7上,同時轉(zhuǎn)化酵母菌AH109。采用濾紙顯色反應(yīng)并檢測β-galact
5、osidase酶活,研究結(jié)果表明,Gr蛋白與番茄乙烯受體蛋白在酵母菌AH109中都能夠穩(wěn)定的表達(dá),并且Gr蛋白與番茄乙烯受體家族的5個蛋白之間都能夠發(fā)生直接的結(jié)合作用,結(jié)合能力基本相似。 (5)酵母雙雜交法研究番茄乙烯受體與CTR蛋白之間的作用模式:通過采用酵母雙雜交的方法,將番茄乙烯受體基因片段與番茄LeCTRl和LeCTR4基因片段分別構(gòu)建雙雜交載體pGAD—T7及pGBK-T7上,同時轉(zhuǎn)化酵母菌AH109。采用濾紙顯色反應(yīng)
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