番茄Gr基因的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、植物激素乙烯影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。而對(duì)于呼吸躍變型果實(shí)，乙烯對(duì)于果實(shí)的成熟、衰老作用十分重要，被稱為成熟激素。植物的乙烯反應(yīng)是通過(guò)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本論文以番茄成熟突變體Green-ripe(Gr)為研究材料，探討Gr基因的功能和作用模式，進(jìn)一步完善番茄的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論。本論文主要做了以下工作： (1)Gr基因的克隆及原核表達(dá)：通過(guò)RT-PCR方法從綠熟期番茄果實(shí)中克隆Gr基因，PCR產(chǎn)物被亞克隆到原核表達(dá)載體pET-

2、30a上，在大腸桿菌BL21中篩選到含有目的基因的重組質(zhì)粒，并采用0.1mM/L的：IPTG誘導(dǎo)3小時(shí)表達(dá)外源蛋白。 (2)Gr蛋白純化及多克隆抗體的制備：應(yīng)用Ni-NTA親和層純化回收Gr蛋白，當(dāng)洗脫液中咪唑濃度達(dá)到40mM/L時(shí)，能夠很好的洗脫外源蛋白，表達(dá)蛋白純度可以達(dá)到96％。采用純化的蛋白免疫兔子制備抗Gr蛋白的多克隆抗體，經(jīng)檢測(cè)多克隆抗體的效價(jià)大于10000，經(jīng)過(guò)DEAE-52離子交換柱純化抗體，可以得到純度較高的抗

3、體。Western blotting檢測(cè)表明，抗Gr蛋白的多克隆抗體具有免疫特異性。 (3)Gr基因表達(dá)模式的研究及細(xì)胞定位研究：研究Gr基因在番茄各組織器官中的表達(dá)模式，并研究外源乙烯處理對(duì)Gr基因表達(dá)的影響。在RNA水平上，采用RT-PCR的方法，證明Gr基因的表達(dá)具有組織特異性，在種子、花及綠熟期番茄果實(shí)中表達(dá)量明顯高于其他部分。而外源乙烯能夠明顯引起花和綠熟期番茄果實(shí)中Gr基因的表達(dá)，說(shuō)明這種乙烯誘導(dǎo)的Gr基因表達(dá)量的降

4、低同樣具有組織特異性。在蛋白水平上，采用Western blotting的方法，利用制備的Gr蛋白的多克隆抗體檢測(cè)Gr蛋白的表達(dá)情況。研究表明Gr在蛋白水平的表達(dá)情況與在RNA水平的表達(dá)情況基本一致。 (4)酵母雙雜交法研究Gr蛋白與乙烯受體蛋白之間的作用模式：通過(guò)采用酵母雙雜交的方法，將Gr基因與乙烯受體基因片段分別構(gòu)建雙雜交載體pGAD-T7及pGBK-T7上，同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母菌AH109。采用濾紙顯色反應(yīng)并檢測(cè)β-galact

5、osidase酶活，研究結(jié)果表明，Gr蛋白與番茄乙烯受體蛋白在酵母菌AH109中都能夠穩(wěn)定的表達(dá)，并且Gr蛋白與番茄乙烯受體家族的5個(gè)蛋白之間都能夠發(fā)生直接的結(jié)合作用，結(jié)合能力基本相似。 (5)酵母雙雜交法研究番茄乙烯受體與CTR蛋白之間的作用模式：通過(guò)采用酵母雙雜交的方法，將番茄乙烯受體基因片段與番茄LeCTRl和LeCTR4基因片段分別構(gòu)建雙雜交載體pGAD—T7及pGBK-T7上，同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母菌AH109。采用濾紙顯色反應(yīng)