TNKS1基因在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)、作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一章 TNKS1在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：探討端錨聚合酶Tankyrasel(TNKS1)在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義。
　　方法：應(yīng)用免疫組化SP法、RT-PCR法及Western blot法,檢測51例新鮮人腦各級別星形細(xì)胞瘤和6例正常腦組織中TNKS1 mRNA和蛋白的表達(dá),并分析其與臨床病理資料之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：與正常腦組織相比,星形細(xì)胞瘤中TNKS1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均

2、明顯升高(P＜0.01),并且TNKS1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著正相關(guān)(r=0.958,P＜0.01)。隨著星形細(xì)胞瘤病理級別的升高,TNKS1在mRNA和蛋白表達(dá)的水平均逐漸升高,各級別之間比較存在差異,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),但TNKS1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在不同性別及年齡組間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：TNKS1 mRNA和蛋白在人腦星形細(xì)胞瘤中呈高水平表達(dá),且隨著星形細(xì)胞瘤病理級別的升高,其

3、表達(dá)水平逐漸升高,提示TNKS1可能作為一癌基因參與了星形細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程,TNKS1有可能作為評價人腦星形細(xì)胞瘤惡性程度的新指標(biāo)之一。
　　第二章 siRNA特異性沉默U251細(xì)胞中TNSK1基因的表達(dá)
　　目的：設(shè)計合成并篩選出特異性沉默人TNKS1基因表達(dá)的siRNA序列,為進(jìn)一步體外研究TNKS1基因沉默對U251細(xì)胞生物學(xué)行為的影響提供材料。
　　方法：以人腦星形細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株為研究對象,首先體外培

4、養(yǎng)U251細(xì)胞,并RT-PCR法檢測TNKS1 mRNA在U251細(xì)胞中的表達(dá)。再針對TNKS1基因設(shè)計3個不同靶點(diǎn)的siRNA干擾序列,通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染入U251細(xì)胞,熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,實(shí)時熒光定量PCR法和Western blot法篩選沉默效率最高的siRNA序列,再將篩選出的TNKS1 siRNA序列轉(zhuǎn)染入U251細(xì)胞,Western blot法檢測其對TNKS1蛋白的抑制作用。
　　結(jié)果：TNKS1在U251細(xì)胞

5、中表達(dá)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA入U251細(xì)胞后,熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率為(84.53±4.39)％。實(shí)時熒光定量PCR法和Westem blot法檢測到組4(TNKS1-siRNA-2239)的TNKS1 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別為較組1(空白對照組)、組2(陰性對照組)、組3(TNKS1-siRNA-3224)、組5(TNKS1-siRNA-1530)明顯下降,存在顯著性差異(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染篩選出的siRNA進(jìn)入U251細(xì)胞

6、,Western blot法定量檢測發(fā)現(xiàn)TNKS1蛋白表達(dá)水平為0.175±0.020,明顯低于空白對照組(0.667±0.015)和陰性對照組(0.630±0.024),具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論：篩選出沉默效率最佳的TNKS1 siRNA干擾序列,并在U251細(xì)胞中成功抑制TNKS1基因的表達(dá),為進(jìn)一步體外研究TNKS1基因沉默對U251細(xì)胞生物學(xué)行為的影響提供基礎(chǔ)。
　　第三章 siRNA沉默TNKS1

7、基因表達(dá)對U251細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：探討siRNA沉默TNKS1基因表達(dá)對U251細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,以明確其在星形細(xì)胞瘤腫瘤形成過程中的可能作用。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為3組:空白對照組(未予任何干擾因素的U251細(xì)胞株),陰性對照組(加入非特異性siRNA/Lipofectamine的U251細(xì)胞株),siRNA干擾實(shí)驗(yàn)組(TNKS1-siRNA-2239.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞株),分別使用MTT法、Tr

8、answell法、流式細(xì)胞儀PI染色法、Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測siRNA沉默TNKS1基因表達(dá)對U251細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果：1、MTT法檢測到在相同時間點(diǎn),siRNA干擾組細(xì)胞生長增殖速度較空白對照組和陰性對照組顯著降低(P＜0.01);2、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)siRNA干擾組U251細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);3、流式細(xì)胞儀PI染色法結(jié)

9、果示siRNA干擾組Anterior G0/G1期細(xì)胞明顯增多,S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05);4、Annexin V/PI雙標(biāo)法結(jié)果示sigNA干擾組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率較對照組明顯增加(P＜0.01)。在上述實(shí)驗(yàn)中,空白對照組和陰性對照組均無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：siRNA沉默TNKS1基因表達(dá)后,可有效抑制U251細(xì)胞的生長增殖,減低其侵襲能力,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　第四章 TNKS1在人腦星

10、形細(xì)胞瘤中的相關(guān)作用機(jī)制的初步研究
　　目的：初步探討TNKS1基因在人腦星形細(xì)胞瘤中的相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：1、選取端粒酶的核心成分端粒酶催化亞單位(hTERT)和端粒重復(fù)單位結(jié)合因子(TRF1)作為研究對象,Western blot法分析在U251細(xì)胞中下調(diào)TNKS1對hTERT和TRF1表達(dá)水平的影響。2、選取Wnt/β-catenin信號通路的核心成分β-catenin作為研究對象,通過免疫組化分析β-caten

11、in在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá),并研究其與TNKS1表達(dá)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：1、siRNA干擾組hTERT蛋白表達(dá)相對水平為0.182±0.031,較空白對照組(0.352±0.026)和陰性對照組(0.347±0.046)明顯降低(P＜0.01);siRNA干擾組TRF1蛋白表達(dá)相對水平為0.271±0.056,較空白對照組(0.094±0.023)和陰性對照組(0.133±0.037)明顯升高(P＜0.01),兩對照組hTER

12、T、TRF1蛋白表達(dá)相對水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。2、與正常腦組織對比,β-catenin在星形細(xì)胞瘤中陽性表達(dá),且在高級別星形細(xì)胞瘤組中表達(dá)明顯強(qiáng)于低級別星形細(xì)胞瘤,具有顯著差異性(P＜0.01),相關(guān)性分析顯示TNKS1蛋白IRS和β-catenin蛋白IRS顯著正相關(guān)(r=0.848,P＜0.01)。
　　結(jié)論：1、U251細(xì)胞中siRNA沉默TNKS1基因表達(dá)可導(dǎo)致hTERT表達(dá)下降,TRF1表達(dá)升高,TNKS